Effects of Methanol Extract of Adlay Bran and Adlay Hull on Progesterone Release in Rat Ovarian Granulosa Cells

薏苡為禾本科一年生草本植物，在中國傳統藥書中對於其功效有很多的記載。在日本有研究顯示，薏苡中具有一種可以誘發女性排卵的化學物質，其他研究也顯示薏苡對於女性排卵障礙有其治療的效果，故推測可能與生殖內分泌有重要的關係。但是目前薏苡萃取物對於性腺類固醇激素的影響及作用機制，瞭解非常有限。本實驗計畫希望深入探討薏苡萃取物對性腺細胞類固醇激素合成與分泌之影響，並探討薏苡萃取物對性腺細胞類固醇激素之作用機轉。實驗將依以下步驟執行，包括:[1] 雌鼠顆粒細胞 (Granulosa cell)與薏仁萃取物，人絨性促素 (hCG)，或forskolin、SQ22536、8-Br-cAMP 等共同培養，培養液中助孕酮 (progesterone) 或pregnenolone 的濃度均以放射免疫測定法(radioimmunoassay，RIA) 檢測；[2] 在機轉的研究方面，給予類固醇激素之前驅物：25-OH-cholesterol、pregnenolone，探討類固醇激素合成酵素，StAR protein及P450scc的活性是否會受到薏仁萃取物之影響；[3] 利用西方點墨法 (Western blotting) 及RT-PCR之方式偵測類固醇激素合成相關蛋白P450scc、StAR之蛋白質表現及基因表現。由實驗結果發現薏苡麩皮甲醇萃取物正丁醇區分層(ABM-Bu)具有抑制助孕酮分泌之效果，其可能的抑制機轉: (一) 抑制cAMP-PKA路徑；(二) 抑制P450scc及3β-HSD之活性；(三) StAR蛋白之蛋白質表現及mRNA表現。本計劃所獲成果可以更進一步證實薏苡萃取物確實對於女性內分泌具有影響的效果。人體一些疾病可能由於內分泌失調的結果，如女性常見的乳癌可能是因為助孕酮分泌過多所導致，而本研究結果發現薏苡萃取物可以抑制助孕酮之分泌，因此可能可以將薏苡開發為一特殊機能性之保健食品，亦可以利用此實驗模式來進行活性測試，進而分離純化出一些具有抑制或促進助孕酮分泌之純化合物，進行新藥的開發工作。Adlay (Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf.) has long been used as traditional Chinese medicine for the dysfunction of endocrine system and inflammation condition. However, the effect of adlay seed on the endocrine system has not yet been reported. In the present study, the effects and the mechanisms of methanolic extract of adlay bran (ABM) on progesterone synthesis in rat granulosa cell were studied. ABM was further partitioned with different solvent including water, 1-butanol, ethyl acetate and n-hexane. Four subfractions named ABM-Wa (water fraction), ABM-Bu (1-butanol fraction), ABM-EA (ethyl acetate fraction) and ABM-Hex (n-hexane fraction) were obtained. ABM-Bu was further fractionated using Diaion HP-20 resin column chromatography with gradient elution. Granulosa cells were prepared from pregnant mare serum gonadotropin-primed immature female rats and challenged with different reagents including human chorionic gonadotropin (hCG, 0.5 IU/ml), forskolin (10 μM), 8-bromo-adenosine-3’,5’-cyclic monophosphate (8-Br-cAMP, 1 mM), A23187 (10 μM), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 0.01 μM), 25-OH-cholesterol (0.1-10 μM) and pregnenolone (0.1-10 μM) in the presence or absence of ABM-Bu (100 μg/ml). The functions of steroidogenic enzyme including protein expression of the steroidogenic acute regulatory protein (StAR) and cytochrome P450 side chain cleavage enzyme (P450scc) protein were investigated. Both P450scc and StAR mRNA expressions have also been explored. We found that ABM decreased progesterone production via an inhibition on (1) the cAMP-PKA Uand PKCU signal transduction pathway, (2) P450scc and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) enzyme activity, (3) P450scc and StAR protein and mRNA expressions, and (4) the phosphorylation of ERK1/2 in rat granulosa cells.目錄……………………………………………………………… Ⅰ 重要名詞中英文對照表………………………………… Ⅳ 圖次 ……………………………………………………………… Ⅴ 表次 ……………………………………………………………… Ⅷ 第一章、 緒論 …………………………………………………… 1 一、 研究目的與假說 ……………………………………………2 第二章、文獻整理…………………………………………………7 一、 卵巢之生理功能…………………………………………… 8 二、雌性性類固醇激素………………………………………………9 (一) 雌性性類固醇激素的分泌細胞…………………………… 9 (二) 雌性性類固醇激素的生理作用………………………… 9 (三) 性類固醇激素的合成……………………………………… 11 (四) 性類固醇激素分泌的調控雌……………………………… 16 (五) 性類固醇激素分泌的細胞內機轉…………………………. 19 三、薏苡的文獻回顧……………………………………………… 22 (一) 薏苡簡介……………………………………………………. 22 (二) 薏苡之生理機能………………………………………….. 23 第三章、激素之檢測及分析…………………………………………35 第四章、不同部位薏苡萃取物及其次區分物對大鼠卵巢顆粒細胞分泌孕酮直接效應及薏苡麩皮甲醇萃取物對cAMP-PKA,鈣離子及PKC路徑作用之探討…………………………………………………… 44 一、前言............................................ 46 二、材料與方法........................................ 47 (一) 薏苡籽實萃取物之製備……………………………………..47 (二) 實驗動物……………………………………………………..48 (三) 卵巢顆粒細胞製備(Granulosa cells)……………………….49 (四) 細胞計數……………………………………………………. 50 (五) 細胞內cAMP之測定……………………………………….. 50 (六)乳酸去氫酶分析法.................................. 51 (七) 不同部位薏苡萃取物對卵巢顆粒細胞分泌孕酮之直接效應...... 52 三、結果……………………………………………………………….55 四、討論………………………………………………………………73 第五章、薏苡麩皮甲醇萃取物正丁醇層對大鼠卵巢顆粒細胞孕酮合成相關酵素活性、mRNA及蛋白質表現之探討…………………………… 77 一、前言………………………………………………………………79 二、材料與方法………………………………………………………80 (一) 實驗動物…………………………………………………… 80 (二) 卵巢顆粒細胞製備 (Granulosa cells)…………………. 80 (三) 西方點墨法分析P450scc及StAR蛋白之蛋白表現……… 80 (四) 反轉錄作用…………………………………………….. 82 (五) 聚合酶連鎖反應………………………………………….. 82 (六) 薏苡麩皮甲醇萃取物正丁醇層，對卵巢顆粒細胞分泌孕酮合成相關效應之影響……………………………………….. 83 三、結果………………………………………………………….. 87 四、討論………………………………………………………….. 98 第六章、薏苡麩皮甲醇萃取物及其次區分物對大鼠腦下腺前葉細胞黃體促素分泌直接效應之探討…………………………………………… 102 一、前言………………………………………………………….. 104 二、材料與方法…………………………………………………… 105 (一) 實驗動物……………………………………………….. 105 (二) 腦下腺前葉細胞 (AP cells)之分離與培養……………… 105 (三) 薏苡麩皮甲醇萃取物次區分層對大鼠腦下腺前葉細胞分泌黃體促素之直接效應…………………………………….. 107 三、結果…………………………………………………………… 108 四、討論……………………………………………………….... 113 第七章、薏苡殼甲醇萃取物對cAMP-PKA路徑作用及對顆粒細胞分泌雌二醇之機轉探討…………………………………………...... 115 一、前言………………………………………………………….. 117 二、材料與方法………………………………………………… 117 (一) 薏苡殼萃取物之製備…………………………………….. 118 (二) 實驗動物………………………………………………….. 118 (三) 卵巢顆粒細胞製備 (Granulosa cells)………………… 118 (四) 薏苡殼甲醇萃取物對卵巢顆粒細胞分泌孕酮及雌二醇之直接效應……………………………………………………. 118 三、結果………………………………………………………….. 123 四、討論………………………………………………………... 134 第八章、薏苡殼甲醇萃取物乙酸乙酯層對大鼠卵巢顆粒細胞孕酮及雌二醇合成相關酵素活性、mRNA及蛋白質表現之探討……137 一、前言………………………………………………………….. 139 二、材料與方法…………………………………………………… 140 (一) 實驗動物……………………………………………………. 140 (二) 卵巢顆粒細胞製備 (Granulosa cells)…..………….. 140 (三) 西方點墨法分析P450scc及StAR蛋白之蛋白表現……… 140 (四) 反轉錄作用……………………………………………….. 140 (五) 即時聚合酶連鎖反應 (Real-Time PCR)………………… 140 (六) 芳香酶(aromatase)活性分析…………………………... 141 (七) 薏苡殼甲醇萃取物乙酸乙酯層，對卵巢顆粒細胞分泌孕酮合成相關效應之影響………………………………………. 141 三、結果…………………………………………………………… 145 四、討論…………………………………………………………… 154 第九章、薏苡殼甲醇萃取物乙酸乙酯層對大鼠卵巢顆粒細胞孕酮及雌二醇合成相關酵素活性、mRNA及蛋白質表現之探討………...157 一、前言……………………………………………………………159 二、材料與方法……………………………………………………160 (一) 活體實驗…………………………………………………. 160 三、結果………………………………………………………….. 162 四、討論………………………………………………………... 166 第十章、綜合討論與結論 …………………………………………………… 167 (一) 綜合討論………………………………………………….. 168 (一) 結論……………………………………………………….. 173 參考文獻 ……………………………………………………………........ 174 附錄……………………………………………………………….. 18