Immunomodulation of the Active Compounds from Black Soybean [Glycine max (L.) Merr.] on Human Mononuclear Cells and the Antiproliferative Effects on U937 Cells

黑豆在傳統中醫藥學被認為是日常保健、醫食俱優的聖品。本實驗試著以Sephadex G-15分子篩膠體區分黑豆酒精沉澱物，並探討各區分物對人類白血病細胞U937的生長抑制情形以及對人類單核球細胞的免疫調節作用。實驗結果顯示黑豆酒精沉澱物在經過Sephadex G15分子篩膠體分離後，可得到分子量大於1500 dalton，且以醣類為主的黑豆區分一樣品(G15 P1)，以及分子量1500 dalton以下之黑豆區分二樣品(G15 P2)。在細胞間接模式下，G15 P2刺激人類單核細胞後所得之條件培養液(MNC-CM)能夠有效抑制U937細胞的生長；而G15 P1則是於直接模式下對U937有明顯抑制作用。為了解G15 P1是否會誘導U937細胞凋亡亦或是透過細胞週期停滯而達到抑制功效，進一步進行U937細胞之DNA片段化實驗，以及檢測G15 P1對U937細胞週期的影響。結果發現U937並無DNA片段化的情形，但停滯於G0/G1期的比率明顯增加，故初步推測G15 P1能透過使U937細胞停滯於G0/G1期來達到抑制生長的效果。由於G15 P2能夠有效刺激人類單核細胞，並進而抑制U937細胞的生長，因此實驗第二部份便探討黑豆各階段區分物對於人類單核細胞的免疫調節作用。實驗結果顯示G15 P2能夠有效促進單核細胞的增生，增生率可達23.6 %，G15 P1則呈現些微的抑制情形；而將G15 P2刺激單核細胞後，分析其條件培養液中細胞激素的含量，亦發現G15 P2能夠有效促進人類單核細胞分泌TNF-α, IL-1β以及IFN-γ之能力。進一步利用G15 P2與人類週邊血液單核細胞培養一天後所得之條件培養液，刺激U937五天後以流式細胞儀檢測其表面抗原CD11b與CD14，其陽性表現率並無顯著增加，故推測在間接模式下G15 P2並無法誘導U937分化為單核球及巨噬細胞。Black soybean [Glycine max (L.) Merr.] has been used as medicinal herb and food for hundreds of years. It also has been reported that black soybean contained numerous bioactive effect like radical-scavenging activity, anti-tumor activity, and activity for improving the fluidity of the whole blood. The water soluble portion of black soybean was precipitated by 75% alcohol and separated by Sephadex G-15 gel to obtain fraction 1(G15 P1) and fraction 2(G15 P2). These two fractions were used separately to stimulate human blood mononuclear cells (MNC) for one day to prepare conditioned medium (MNC-CM-1). U937 cells were incubated with condition medium for 5 days and the growth inhibition were studied. Results showed that G15 P2 stimulates human blood mononuclear cells to inhibit the cell growth of human myelocytic lymphoma U937 cells. It was also found that the MNC proliferated about 23.6 % and the MNC-CM-1 contained high levels of TNF-α, IL-1β and IFN-γ. However, in the investigation of the expression of monocyte-associated cell surface marker CD11b and CD14 on U937, we did not found differentiation of U937 cells after G15 P2 treatment. In the directly inhibitory experiments, we found G15 P1 at a dosage of 200第一章 文獻回顧 1 ㄧ、癌症簡介 1 二、黑豆介紹 1 三、黑豆的營養及活性成分 2 四、黑豆的生理活性 3 五、免疫系統的組成與保護功能 4 (一) 非專一性免疫反應 5 1. 解剖性的防禦 5 2. 生理性的防禦 5 3. 噬菌性的防禦 5 4. 發炎反應 5 (二) 專一性免疫反應 6 (三) 巨噬細胞與單核球 6 (四) 顆粒性白血球 7 (五) 細胞激素 8 1. 干擾素 8 2. 間白素 8 3. 株落刺激因子 9 4. 其他細胞激素 9 六、白血病 11 (一) 急性白血病的症狀及診斷方法 12 (二) 慢性白血病症狀及診斷方法 12 (三) 白血病的治療 12 七、人類白血病細胞株U937 13 (一) 細胞黏附及型態變化 13 (二) 細胞表面抗原測定 14 (三) 吞噬試驗 14 (四) NSE染色法 14 (五) NBT還原試驗 14 八、細胞週期調控之影響 15 九、細胞凋亡 16 (ㄧ) 細胞凋亡之定義 16 (二) 細胞凋亡之分期 17 十、流式細胞技術 17 十一、研究動機與目的 18 第二章 材料與方法 21 ㄧ、黑豆各階段樣品製備 21 (一) 黑豆萃取流程 21 (二) 實驗材料 22 1. 原料來源 22 2. 實驗試藥 22 3. 實驗器材與儀器 22 (三) 萃取方法與步驟 23 1. 黑豆浸泡液酒精沉澱物之萃取 23 2. 膠體管柱層析區分黑豆萃取物 23 3. 蛋白質定量 24 4. 總醣類定量 24 5. 總酚含量測定 25 二、黑豆免疫活性物質對人類白血病細胞U937之作用 26 (一) 實驗材料 26 1. 樣品來源 26 2. 實驗細胞 26 3. 實驗試藥 26 4. 實驗器材與儀器 27 (二) 實驗方法與步驟 28 1. 細胞解凍 28 2. 細胞冷凍 29 3. 細胞存活率 29 4. 人類單核細胞的分離 30 5. 人類單核細胞條件培養液(MNC-CM)之製備 30 6. 樣品條件培養液對U937的抑制作用（間接模式） 31 7. 樣品對人類白血病細胞株 (U937) 抑制作用 (直接模式) 31 8. DNA片段化分析 32 (1) DNA萃取 32 (2) 1.5％膠體製備 33 (3) DNA電泳 33 9. 細胞週期分析 33 10. 統計分析 34 三、黑豆免疫活性物質對人類單核細胞之免疫調節作用 35 (一) 實驗流程 35 (二) 實驗材料 36 1. 樣品來源 36 2. 實驗細胞 36 3. 實驗試藥 36 4. 實驗器材與儀器 37 (三) 實驗方法與步驟 38 1. 人類單核細胞的分離 38 2. 樣品對人類單核球細胞之增生作用 38 3. 人類單核細胞條件培養液(MNC-CM)之製備 39 4. 人類單核細胞條件培養液中細胞激素分泌量之分析 39 5. 人類白血病細胞株U937表面抗原之分析 40 第三章 實驗結果 41 ㄧ、黑豆各階段樣品製備 41 (一) 黑豆浸泡液酒精沉澱物之管柱層析 41 (二) 黑豆浸泡液各階段區分物總醣含量、蛋白質含量與總酚含量 41 二、黑豆免疫活性物質對人類白血病細胞U937之作用 43 (一) 樣品條件培養液對U937的間接抑制作用 43 (二) 黑豆各階段區分物對U937的直接生長抑制作用 43 (三) DNA片段化測定 44 (四) G15 P1對U937細胞週期之影響 44 三、黑豆免疫活性物質對人類單核細胞之免疫調節作用 46 (一) 樣品對人類單核球細胞之增生作用 46 (二) 人類單核細胞條件培養液中細胞激素分泌量之分析 46 (三) U937細胞表面抗原CD11b與CD14之分析 47 第四章 討論 48 第五章 結論 53 結果圖表 54 參考文獻 77 附錄 82 表目錄 表一、黑豆浸泡液各階段區分物總醣含量、蛋白質含量與總酚含量 55 表二、黑豆各階段區分物刺激人類單核球細胞後的條件培養液對U937的生長抑制率 56 表三、黑豆各階段區分物對U937的直接生長抑制率 57 圖目錄 圖一、顆粒性白血球的形態學 9 圖二、細胞激素調控白血球的活化與分化 10 圖三、Apoptosis 和 Necrosis的分別 20 圖四、黑豆浸泡液酒精沉澱物之Sephadex G-15管柱層析圖 54 圖五、G15 P1(50, 100, 200 mg/mL)於第五天誘導U937細胞DNA片段化之電泳圖形 58 圖六、U937細胞與不同濃度G15 P1共同培養1天後細胞週期之改變(A) Control (B) 50 μg/mL (C) 100 μg/mL (D) 200 μg/mL 59 圖七、G15 P1對U937細胞培養1天後之細胞週期變化比較 60 圖八、U937細胞與不同濃度G15 P1共同培養3天後細胞週期之改變(A) Control (B) 50 μg/mL (C) 100 μg/mL (D) 200 μg/mL 61 圖九、G15 P1對U937細胞培養3天後之細胞週期變化比較 62 圖十、U937細胞與不同濃度G15 P1共同培養5天後細胞週期之改變(A) Control (B) 50 μg/mL (C) 100 μg/mL (D) 200 μg/mL 63 圖十一、G15 P1對U937細胞培養5天後之細胞週期變化比較 64 圖十二、G15 P1對U937細胞培養1、3和5天後細胞週期之變化 65 接續圖十二、G15 P1對U937細胞培養1、3、5天後細胞週期之變化 66 圖十三、黑豆各階段區分物刺激人類單核細胞一天後之影響 67 圖十四、黑豆各階段區分物刺激人類單核細胞三天後之影響 68 圖十五(A)、不同濃度之G15 P2與MNC共同培養一天後其條件培養液 69 圖十五(B)、不同濃度之G15 P2和polymyxin B共同培養一天後其條件培養液中TNF-α含量之比較 70 圖十六(A)、不同濃度之G15 P2與MNC共同培養一天後其條件培養液 71 圖十六(B)、不同濃度之G15 P2和polymyxin B共同培養一天後其條件培養液中IL-1β含量之比較 72 圖十七(A)、不同濃度之G15 P2與MNC共同培養一天後其條件培養液 73 圖十七(B)、不同濃度之G15 P2和polymyxin B共同培養一天後其條 件培養液中IFN-γ含量之比較 74 圖十八、U937間接作用後細胞之CD11b表現率 75 圖十九、U937間接作用後細胞之CD14表現率 7