Enzymatic Degradation of Gracilaria

本研究探討以纖維素水解酶(Cellulase)水解醣類生質(蔗渣、龍鬚菜)的最佳條件(溫度50℃，pH 4.6)。並且比較醣類生質未經前處理及經過酸處理(基質加入0.2 M H2SO4，以殺菌釜加溫至121℃處理半小時)、冷凍前處理(基質加入去離子水浸泡，並於-10℃下靜置20分鐘)後的酵素水解速率差異。醣類生質經酵素水解成單醣、雙醣及寡醣後，再利用DNS (Dinitrosalicylic acid)定量還原端產生的量，以推估酵素水解效率。另外，利用酚-硫酸法以及葡萄糖感測器來定量酵素水解後產生的總醣濃度及葡萄糖濃度。本研究所開發的海藻生質，在經過冷凍前處理後確實提高了酵素水解速率以及醣類增加量，可望有效應用於生質能源領域。Lignocellulosic biomass has been utilized to produce ethanol in the last two decades. The main process involved in this conversion is hydrolysis of cellulose in the lignocellulosic materials to produce reducing sugars. Due to the recalcitrant nature, the biomass can not be easily converted to monomeric sugars. Therefore, the low yield and high cost of the hydrolysis process are the major challenges in biomass energy development. In our research, marine seaweeds Gracilaria is used as the biomass. Owing to their hydration ability, an “Ice-crystal pretreatment” is developed to enhance the hydrolysis of cellulosic biomass. The enzymatic hydrolysate of biomass was measured by three methods. Reducing sugars is determined by the dinitrosalicylic method (DNS). Total soluble sugars is determined by the phenol-sulphuric acid method. Glucose is determined by the glucose biosensor. In our result, the validity of “Ice-crystal pretreatment” were confirmed. The effect of “Ice-crystal pretreatment” was also compared with acid pretreatment. In conclusion, marine seaweeds Gracilaria with “Ice-crystal pretreatment” may be a new approach to biomass energy development in the future.目 錄 ================= 致謝 i 中文摘要 ii 英文摘要 iii 目錄 iv 圖目錄 vii 表目錄 ix 第一章 前言 1 第二章 文獻探討 2 2.1生質能源 2 2.1.1醣類 7 2.1.2纖維素 10 2.2多醣水解 12 2.2.1前處理 12 2.2.1.1物理前處理 12 2.2.1.2化學前處理 13 2.2.1.3冷凍前處理 14 2.2.2酵素水解 15 2.3量測方法 17 2.3.1還原醣測定法 17 2.3.2總醣測定法 20 2.3.3葡萄糖測定法 21 第三章 材料與方法 23 3.1實驗藥品與儀器設備 23 3.1.1實驗藥品 23 3.1.2儀器設備 23 3.1.3分析試劑與感測系統製備 24 3.2蔗渣、龍鬚菜的樣品前處理 25 3.2.1硫酸前處理 25 3.2.2冷凍前處理 25 3.3多醣的酵素水解流程 25 3.4酵素水解產物的檢測方法 26 3.4.1還原醣測定法 26 3.4.2總醣測定法 26 3.4.3葡萄糖測定法 26 第四章 結果與討論 28 4.1纖維素水解酶對纖維素的水解效率之最佳化探討 28 4.1.1溫度對纖維素水解酶水解效率的影響 28 4.1.2 pH對纖維素水解酶水解效率的影響 31 4.2前處理過程對纖維素水解酶水解效率的影響 33 4.2.1蔗渣、龍鬚菜未經前處理過程之酵素水解效率探討 33 4.2.2蔗渣、龍鬚菜經酸前處理過程之酵素水解效率探討 35 4.2.3蔗渣、龍鬚菜經冷凍前處理過程之酵素水解效率探討 38 4.3酵素水解產物的上清液醣類濃度量測 41 4.3.1以酚-硫酸法檢測酵素水解產物的上清液總醣濃度 41 4.3.2以葡萄糖感測器檢測酵素水解產物的上清液葡萄糖濃度 48 第五章 結論與未來展望 52 參考文獻 54 圖 目 錄 ================= 圖2-1海藻萃取Agar的流程圖 6 圖2-2各種醛醣類的結構式 8 圖2-3纖維素的化學結構圖 11 圖2-4(A)纖維素的微纖維結構(B)植物粗纖維結構 11 圖2-5纖維素水解酶的種類與作用機制 16 圖2-6纖維素的結構圖(包含還原端與非還原端) 18 圖2-7 DNS反應機制 19 圖2-8三極式葡萄糖感測器示意圖 22 圖3-1多醣水解實驗流程圖 27 圖4-1不同溫度對纖維素水解酶水解纖維素的效率探討 30 圖4-2不同pH對纖維素水解酶水解纖維素的效率探討 32 圖4-3纖維素水解酶水解未經前處理的蔗渣、龍鬚菜的效率探討 34 圖4-4纖維素水解酶水解經過酸前處理的蔗渣、龍鬚菜的效率探討 37 圖4-5纖維素水解酶水解經過冷凍前處理的蔗渣、龍鬚菜的效率探討 39 圖4-6蔗渣、龍鬚菜在冷凍顯微鏡下即時觀測冰晶成長情形 40 圖4-7蔗渣、龍鬚菜加入甘油後在冷凍顯微鏡下即時觀測冰晶成長情形 40 圖4-8酚-硫酸法的檢量線 44 圖4-9蔗渣經過不同前處理後的上清液總醣濃度隨纖維素水解酶水解時間變化圖 45 圖4-10龍鬚菜經過不同前處理後的上清液總醣濃度隨纖維素水解酶水解時間變化圖 46 圖4-11葡萄糖感測器系統的典型響應圖 50 表 目 錄 ================= 表2-1 Biomass的種類及分類 4 表2-2世界各國龍鬚菜、石花菜的每年總產量 5 表2-3同質多醣的分類 9 表4-1不同前處理後的蔗渣、龍鬚菜的上清液總醣濃度以及醣類轉換率 47 表4-2不同前處理後的蔗渣、龍鬚菜的葡萄糖濃度 5