Effect of Collagen Conformation and Components on Adhesion, Growth and Functions of Osteoblast-Like Cells

膠原蛋白（Collagen），是多細胞動物體內含量最多的蛋白質，幾乎存在於所有組織中。膠原蛋白被廣泛應用在醫學上之生醫材料，如組織生長、燒燙傷敷料、傷口癒合等。本研究的目標在於探討膠原蛋白的型態，和glycosaminoglycan（GAG）對於骨母細胞貼附、生長與功能的影響。我們在tissue culture polystyrene（TCPS）表面上，塗佈膠原蛋白（soluble collagen）、纖維狀膠原蛋白（fibrous collagen）以及在高溫下變性膠原蛋白（denatured collagen），再將骨母細胞接種在上面，觀察細胞在不同表面上的貼附量、細胞型態、生長情況，以及功能表現。我們發現，塗佈上soluble collagen與fibrous collagen的表面，對於細胞貼附及生長效果比denatured collagen表面好，同時其鹼性磷酸酶（Alkaline Phosphatase）的活性也比較大。此外，我們也發現將膠原蛋白與肝素（heparin）之混合液塗佈在TCPS上，當肝素濃度為0.02 mg / mL時，對於細胞貼附的促進效果最佳，並且混合液會隨著肝素濃度的增加，細胞數有減少的趨勢。Collagen and glycosaminoglycans are the major components of extracellular matrix, and are important in tissue formation and tissue engineering. This study was proposed to investigate the effects of conformation of type I collagen, and the effects of glycosaminoglycan on adhesion, proliferation and function of human osteosarcoma MG-63. Cells were seeded on TCPS plates coated with soluble collagen, fibrous collagen and heat-denatured collagen, or mixture of collagen and heparin. The attachment, morphology, growth and functions of cells were examined. We found that soluble collagen and fibrous collagen promoted cell attachment and growth more than denatured collagen. Cells cultured on soluble collagen coated plate had higher alkaline phosphatase activity than on the other substrates. In addition, we found that the plate coated with mixture of 0.02 mg/mL heparin and collagen supported better cell adhesion than the substrates coated with higher heparin concentration.本研究中主要分成三大部份， 首先我們以methacrylic acid （MAA）為單體、trimethylolpropane trimethacrylate（TRIM）為交聯 劑，在目標分子（template）—嗎啡（morphine, MO）的存在下，利 用沈澱聚合（precipitation polymerization）的方法製作出嗎啡分子模 版（molecularly imprinted polymer, MIP），比較傳統塊狀聚合（bulk polymerization）與沈澱聚合所製備分子模版的粒徑分布、表面形態與 表面積等特性分析，並以styrene與MAA單體掺混的方式聚合分子模 版，比較不同官能基單體掺混對嗎啡的吸附效果，分析單體官能基與 模版選擇性的影響，並在不同嗎啡濃度下測量分子模版吸附量，以 Scatchard plot估算沈澱聚合分子模版的脫附常數（KD）為0.45 mM與 吸附嗎啡的最大量（Bmax）可達186 µmole/g。 第二部分，將3,4-Ethylenedioxythiophene (EDOT)作為單體，以 電聚方式包覆沈澱聚合後之分子模版於導電玻璃ITO 上作為修飾電 極（MIP/PEDOT），以定電位方法感測嗎啡，線性感測範圍為0.1~2.0 mM，MIP/PEDOT 修飾電極的靈敏度為41.63 µA/cm2 *mM，感測下限 為0.3 mM（S/N=3），模版效率為1.11。另一方面以EDOT 做為模版 單體，分別合成嗎啡（MIP-PEDOTMO）與膽固醇（MIP-PEDOTChol） 分子模版修飾電極，以PEDOT 薄膜催化嗎啡的能力，定電位的方式 感測嗎啡，線性感測範圍為0.1~1 mM，MIP-PEDOTMO 修飾電極的靈 敏度為91.86 µA/cm2 *mM，感測下限為0.2 mM（S/N=3），模版效率為1.32。膽固醇感測方面，因為膽固醇為非電活性物質，所以無法直 接以電流的訊號判斷濃度，故於溶液中加入赤血鹽為電流指示劑，利 用MIP-PEDOTChol 修飾電極上膽固醇的特殊孔洞，對吸附膽固醇後造 成PEDOT 高分子鏈的收縮，使得指示劑分子於修飾膜中通透量增 加，間接測量指示劑電流與濃度的關係來感測溶液中的膽固醇， MIP-PEDOTChol 修飾電極吸附膽固醇後電流變化的線性範圍為0~20 70 圖3-35 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上不同型態膠原蛋白，經過培養7天後，ALP 、osteopontin及type I collagen（col I）對GAPDH之相對強度。（第98代骨母細胞） 70 圖3-36 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上不同型態膠原蛋白，經過培養7天後，ALP 、osteopontin及type I collagen（col I）對GAPDH之相對強度（第99代骨母細胞） 71 圖3-37 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上不同型態膠原蛋白，經過培養7天後，ALP 、osteopontin及type I collagen（col I）對GAPDH之相對強度（第95代骨母細胞） 71 圖3-38 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養4和24小時後測得之細胞數 72 圖3-39 在無血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養4和24小時後測得之細胞數 72 圖3-40 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養4和24小時後測得之鹼性磷酸酶活性 73 圖3-41 在無血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養4和24小時後測得之鹼性磷酸酶活性 73 圖3-42 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養1小時後之細胞型態 74 圖3-43 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養2小時後之細胞型態 75 圖3-44 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養4小時後之細胞型態 76 圖3-45 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養24小時後之細胞型態 77 圖3-46 在無血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養1小時後之細胞型態 78 圖3-47 在無血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養2小時後之細胞型態 79 圖3-48 在無血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養4小時後之細胞型態 80 圖3-49 在無血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養24小時後之細胞型態 81 圖3-50 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養1天和3天後測得之細胞數 82 圖3-51 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養1天和3天後測得之鹼性磷性酶活性 82 圖3-52 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養1天和3天後測得之細胞數 83 圖3-53 在有血清的培養液中，並於材料表面塗佈上膠原蛋白及肝素與膠原蛋白之混合液，經培養1天和3天後測得之鹼性磷酸酶活性 8