Studies of Separation and pKa values of Flavone in Capillary Zone Electrophoresis

本論文利用毛細管區帶電泳法探討七種類黃酮分析物之分離及pKa値的效應。首先變化毛細管電泳的分離條件如pH值(7.0~11.0)、緩衝溶液種類(磷酸、硼酸或磷酸-硼酸混合)及濃度(25 ~ 75 mM)、添加之界面活性劑SDS濃度(3 ~ 15 mM)及施加電壓(20 kV)，以尋找最適化之分離條件。實驗結果顯示，以25 mM磷酸-硼酸混合緩衝溶液( pH 9.2)，加入3 mM SDS作為添加剤，施加20 kV之電壓，能有效分離七種類黃酮分析物。緩衝溶液的pH值和取代基推拉電子的效應對類黃酮分析物的分離及pKa值有很大的影響。經由電泳遷移率對pH值作圖之最佳曲線模擬，可得到分析物之pKa 值和極限遷移速率。由分離機制的討論中，單取代pKa大小為C3-OH flavone ＞ C6-OH flavone ＞ C4’-OH flavanone ＞ C2’-OH flavanone ＞ C7-OH flavone，經由添加3 mM SDS，由於解離後極性不同與SDS作用有差異，因此遷移順序為C3-OH flavone ＞ C4’-OH flavanone ＞ C2’-OH flavanone ＞ C7-OH flavone ＞ C6-OH flavone。此外，C4’-OH和C2’-OH flavanone的C2位置為chiral center，嘗試以β-CD、s-β-CD等作為對掌添加劑，探討緩衝溶液pH值與添加劑濃度影響，分離2’-OH flavanone 在50 mM 磷酸-硼酸混合緩衝溶液(pH 9.3)，2.5 mM β-CD為最適分離結果。而4’-OH flavanone嘗試β-CD (0-15 mM)、HP-β-CD(1.5-25 mM)、γ-CD(10-25mM)變化pH範圍(9.3-10)都無法有好的對掌分離效果，在50 mM磷酸緩衝溶液(pH 3.0)，3.5% s-β-CD 有最適的對掌分離結果。The influence of pH on the electrophoretic behavior of seven flavone in capillary zone electrophoresis (CZE) was investigated. With the use of an appropriate mobility equation and with the aid of computer simulation through the analysis of mobility curves. The determination of pKa values allows us to rationalize the influence of pH on the electrophoretic behavior of these compounds in CZE. Capillary zone electrophoresis has proven to be a powerful technique for separation. In this study, seven flavone will be separation by using SDS as additive. The optimum electrolyte buffer of CZE was 25 mM mixing of phosphate and borate buffer(pH 9.2), 3 mM SDS, and apply 20 kV. In the other part, we focus on the enantioseparation of 2’-hytroxyflavanone and 4’- hydroxyflavanone with addition of β-CD and sulfate-substituted β-CD (MI-S-β-CD) and the optimization of separation.The optimum enantioseparation of 2’-hytroxyflavanone is 50 mM mixing of phosphate and borate buffer(pH 9.3), 2.5 mM β-CD.Then, the optimum enantioseparation of 4’-hytroxyflavanone is 50 mM phosphate buffer(pH 3.0), 3.5 % s-β-CD.目錄 中文摘要………………………………………………………………....Ι 英文摘要………………………………………………………………...II 目錄……………………………………………………………………..IΙΙ表目錄………………………………………………………………....VII 圖目錄……………………………………………………………….VIII 第一章 緒論 1.1 毛細管電泳的發展………………………………………………1 1.2 毛細管電泳的分離原理…………………………………………3 1.2.1 電泳……………………………………………………….3 1.2.2 Zeta電位與電滲流………………………………………4 1.3 分離模式……………...…………………….………………….….8 1.3.1 毛細管區带電泳法..………………………………………9 1.3.2 微胞電動力層析法……………………………………… 9 1.4 以環糊精區带電泳法對鏡像異構物和非鏡像異構物的分離….11 1.5 毛細管電泳的裝置………………………………………………12 1.6 毛細管電泳在超微量分析上的研究……………………………12 1.7 研究動機…………………………………………………………13 1.8 參考文獻…………………………………………………………16 第二章 毛細管區带電泳法對類黃酮分析物之分離與pKa 値之探討 2.1 前言……………………………………………………………….20 2.1.1 相關文獻…………………………………………………23 2.1.2 分析物結構………………………………………………28 2.1.3 研究動機與目……………………………………………32 2.2 實驗…...……………………………………………………………32 2.2.1 儀器………………………………………………………32 2.2.1.1 毛細管電泳儀………………………………………32 2.2.1.2 酸鹼度測定…………………………………………33 2.2.1.3 毛細管柱……………………………………………33 2.2.2 藥品………………………………………………………34 2.2.2.1 分析物………………………………………………34 2.2.2.2 緩衝溶液……………………………………………34 2.2.2.3 其他試藥……………………………………………34 2.2.3 實驗方法…………………………………………………34 2.2.3.1 毛細管的處理………………………………………34 2.2.3.2 藥品配製……………………………………………35 2.2.3.3 實驗操作條件………………………………………36 2.2.4 電泳遷移率計算公式……………………………………36 2.3 結果與討論………….……………………………………………37 2.3.1 緩衝溶液的選擇…………………………………………37 2.3.2 緩衝溶液的濃度的效應…………………………………38 2.3.3 緩衝溶液的pH效應…………………………………….38 2.3.4 添加劑SDS的效應…………..………………………….40 2.3.5 電泳遷移率與pH的關係……………………………….41 2.3.5.1 分析物解離常數pKa的測定……………………….45 2.3.5.2 分析物結構及作用力與所求得pKa值之關係…….49 2.4 結論……………………………………………………………….50 第三章 以硫酸鹽衍生化環糊精和中性環糊精對類黃酮之分 離 3.1 前言……………………………………………………………….71 3.2 環糊精性質簡介………………………………………………….71 3.2.1 環糊精對對掌異構物分離的原理………………………72 3.3 實驗……………………………………………………………….72 3.3.1 儀器………………………………………………………72 3.3.2 藥品………………………………………………………72 3.3.2.1 分析物………………………………………………72 3.3.2.2 緩衝溶液……………………………………………72 3.3.2.3 其他試藥……………………………………………72 3.3.3 實驗方法…………………………………………………72 3.3.3.1 毛細管的處理………………………………………72 3.3.3.2 藥品配製……………………………………………72 3.3.3.3 實驗操作條件………………………………………72 3.3.4 電泳遷移率計算公式……………………………………72 3.4 結果與討論……………………………………………………….73 3.4.1 分析物對掌分離之探討…………………………………73 3.4.2 緩衝溶液pH的影響……………….…………………….74 3.4.3 s-β-CD濃度的影響………………………………………..75 3.5 結論……………………………………………………………….81 3.6 參考資料………………………………………………………….81 表目錄 表2-1 七種類黃酮分析物的pKa值與極限電泳遷移率………………70 表3-1 環糊精基本結構………….…………………………………….83 圖目錄 圖1-1 毛細管內電雙層模型…………………………………..………18 圖1-2 毛細管電泳儀裝置示意圖……………………………….….…19 圖2-1 七種類黃酮分析物在不同濃度緩衝溶液下的電泳圖……......51 圖2-2A 七種類黃酮分析物電泳遷移率對pH值的關係圖...…..……52 圖2-2B 七種類黃酮分析物在不同pH值下的電泳圖………………53 圖2-3A 七種類黃酮分析物在SDS濃度變化的電泳圖………..……54 圖2-3B 七種類黃酮的電泳遷移率對緩衝溶液SDS濃度變化的關係 圖…………………………………………………………..…55 圖2-4 七種類黃酮分析物最佳分離條件電泳圖……………..………56 圖2-5A 分析物4’-Hydroxyflavanone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，不同pH之電泳圖………………………….……….…57 圖2-5B 分析物4’-Hydroxyflavanone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線………………58 圖2-6A 分析物2’-Hydroxyflavanone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，不同pH之電泳圖……………………………………59 圖2-6B 分析物2’-Hydroxyflavanone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線………………60 圖2-7A 分析物7-Hydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，不同pH之電泳圖……………………………………61 圖2-7B 分析物7-Hydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線………………62 圖2-8A 分析物6-Hydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，不同pH之電泳圖……………………………………63 圖2-8B 分析物6-Hydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線………………64 圖2-9A 分析物3-Hydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，不同pH之電泳圖……………………………………65 圖2-9B 分析物3-Hydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶 液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線………………66 圖2-10A 分析物3,7-Dihydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶液下，不同pH之電泳圖…………………………………67 圖2-10B 分析物3,7-Dihydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線……………68 圖2-11A 分析物7,2’-Dihydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶液下，不同pH之電泳圖…………………………………69 圖2-11B 分析物7,2’-Dihydroxyflavone在25 mM混合磷酸-硼酸緩衝溶液下，經由公式(2-2)所計算出來的模擬曲線……………70 圖3-1 環糊精基本結構……………………………..…………………83 圖3-2 在緩衝溶液中(pH 9.3)添加β-CD試劑對分析物(2)2’-Hydroxyflavanone分離的電泳圖…………….…………84 圖3-3 在緩衝溶液中(pH 9.3)添加β-CD試劑對分析物(2)2’-Hydroxyflavanone對掌分離Rs的關係圖………………85 圖3-4 在緩衝溶液中(pH 9.3)添加β-CD(2.5mM)試劑對分析物(2)2’-Hydroxyflavanone分離的電泳圖…………….….………86 圖3-5 在緩衝溶液中(pH 9.3)添加β-CD試劑濃度對分析物(1)4’-Hydroxyflavanone分離的電泳圖………………..………87 圖3-6 磷酸鹽緩衝溶液pH值對分析物(1)4’-Hydroxyflavanone對掌分離的電泳圖……………………………………….….…………88 圖3-7 磷酸鹽緩衝溶液pH值對分析物(1)4’-Hydroxyflavanone對掌分離Rs的關係圖……………………………………….…………89 圖3-8 在緩衝溶液中(pH 3.0)添加s-β-CD試劑對分析物(1)4’-Hydroxyflavanone分離的電泳圖……………..…………90 圖3-9 在緩衝溶液中(pH 3.0)添加s-β-CD試劑濃度對分析物(1)4’-Hydroxyflavanone對掌分離Rs的關係圖……….………9