行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告:由肌動蛋白收縮會合ERK activation所活化細胞死亡之蛋白質體研究

不同種類的細胞在處理phorbol ester ( P MA )時，有的細胞株會走向分化，有的會誘姿凋亡，而人類骨髓白血癌細胞株DZ 處理PMA 時，約一半的細胞將走向分化而貼覆於培養皿、另一部分的細胞則將走向凋亡。在我們的研究中發現抑制Rho kinase 的活性或肌動蛋白收縮將阻斷凋亡的發生，而使細胞全數走向分化，證實了RhoA/RocK 活化所造成的myosin 滑動收縮的機制，對細胞因應刺激而決定其命運的過程中扮演一決定性角色。我們利用蛋白質二維電泳配合質譜分析嘗試尋找在PMA 誘發細胞凋亡的過程中受Rock 活化調控的分子變化，結果發現heterogeneous ouclear ribonucleoproteinc ( hnRNP CI132/ C2 )隨著Rock 的活化改變其細胞分布，由細胞核移到細胞質；利用西方轉漬及細胞免疫螢光染色證實該現象只會發生於PMA 誘發凋亡的細胞，而不會發生於未處理藥物或PMA 誘發分化的細胞中。我們進一步探討其分子機制，發現hnRNP CI1/ C2 的細胞分布改變乃是導因於細胞骨架發生重整，而非伴隨於細胞凋亡的執行所產生的現象。在H 五K293T 細胞中過量表現持續活化態的ROCK ( ROCK -CAT ) ，除了造成細胞產生皺縮也同時發生h 九RNPC1 / C2 分布於細胞質的現象。由上述結果指出，在PMA 誘發凋亡的細胞中，透過ROCK 活化而產生細胞骨架重整，進而造成h 利良NPC1/ C2 的分布由細胞核轉移到細胞質的現象。不同種類的細胞在處理phorbol ester ( P MA )時，有的細胞株會走向分化，有的會誘姿凋亡，而人類骨髓白血癌細胞株DZ 處理PMA 時，約一半的細胞將走向分化而貼覆於培養皿、另一部分的細胞則將走向凋亡。在我們的研究中發現抑制Rho kinase 的活性或肌動蛋白收縮將阻斷凋亡的發生，而使細胞全數走向分化，證實了RhoA/RocK 活化所造成的myosin 滑動收縮的機制，對細胞因應刺激而決定其命運的過程中扮演一決定性角色。我們利用蛋白質二維電泳配合質譜分析嘗試尋找在PMA 誘發細胞凋亡的過程中受Rock 活化調控的分子變化，結果發現heterogeneous ouclear ribonucleoproteinc ( hnRNP CI132/ C2 )隨著Rock 的活化改變其細胞分布，由細胞核移到細胞質；利用西方轉漬及細胞免疫螢光染色證實該現象只會發生於PMA 誘發凋亡的細胞，而不會發生於未處理藥物或PMA 誘發分化的細胞中。我們進一步探討其分子機制，發現hnRNP CI1/ C2 的細胞分布改變乃是導因於細胞骨架發生重整，而非伴隨於細胞凋亡的執行所產生的現象。在H 五K293T 細胞中過量表現持續活化態的ROCK ( ROCK -CAT ) ，除了造成細胞產生皺縮也同時發生h 九RNPC1 / C2 分布於細胞質的現象。由上述結果指出，在PMA 誘發凋亡的細胞中，透過ROCK 活化而產生細胞骨架重整，進而造成h 利良NPC1/ C2 的分布由細胞核轉移到細胞質的現象。Treatment of cells with phorbol- I 2-myristate- 13-acetate (PMA) can induce terminal differentiation or apoptosis, depending on cell types. In D2 cells, an erythroblastic cell line, PMA treatment induces a portion of cells displayed adhesion; others remained in suspension and underwent apoptosis. In this study we provide evidence that inhibition of Rho kinase (ROCK) activation or myosin contractility abrogates PMA-induced apoptosis, and turns cells to undergo PMA-induced differentiation program, suggesting a switching role for the RhoAJROCK/myosin contraction pathway in cell fate decision. Using 2DE analysis system coupled with mass spectrometric analysis, we identified protein spots corresponding to heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C (hnRIsiP C1/C2), a nuclear RNA binding protein, whose distribution in the cytosolic fraction was dependent on ROCK activation. By Western blot analysis and immunofluorescence staining, we confirmed that the cytosolic translocation of hn.RNP C1/C2 is only present in PMA-inducecl apoptotic cells, but not in proliferating or PMA-induced differentiating cells. We also found that the cytosolic distribution of hnRNP Cl/C2 in PMA-induced apoptotic cells is dependent on cytoskeleton rearrangement, and is independent of apoptotic execution. Overexpression of dominant active form of ROCK (ROCK-CAT) also impairs the nuclear retention of hnRNP C 1/C2 in HEK293T cells, accompanied with cell contraction. Our data indicate that the translocation of hnRNP Cl/C2 from nuclei to cytoplasm is one of the features regulated by ROCK-mediated cytoskeleton change in PM.A-induced apoptotic cells