Analysis of the toxicity mechanism of zinc oxide nanoparticles aiming at their application as innovative anti-tumor agent

Die Entwicklung innovativer nanopartikelbasierter Therapeutika ist gegenwärtig in der Medizin ein großes Thema und auch in der Tumortherapie ruhen viele Hoffnungen auf der Nanomedizin. Gleichzeitig ist die Beurteilung unerwünschter Nebenwirkungen bei nanomedizinischen Therapeutika jedoch eine große Herausforderung, da zwischen Nanopartikeln und dem menschlichen Körper vollkommen neue Interaktionsmöglichkeiten bestehen. Diese Doktorarbeit befasst sich mit dem Toxizitätsmechanismus von Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NP) und ihrer potenziellen Anwendung als innovatives Krebstherapeutikum. Metalloxid-Nanopartikel wie ZnO NP stellen eine besondere Herausforderung dar, da sie in der Lage sind Metallionen frei zu setzen und so über viele unterschiedliche Mechanismen mit dem Körper zu interagieren. Um eine Translation dieser Partikel in die klinische Praxis zu ermöglichen ist es fundamental wichtig ihr Verhalten in biologischen Systemen im Detail zu verstehen, um so ihre Toxizität genau kontrollieren zu können. Diese Studie wurde mit ZnO NP einer Größe von 5 22 nm durchgeführt, die ein Zeta Potential von 20 30 mV aufwiesen. In wässrigem Medium bildeten sie schnell Agglomerate und Präzipitate. Zudem kam es zur Auflösung der Partikel und zur Freisetzung von Zinkionen (Zn2+). Etwa ein Viertel aller in den Partikeln enthaltenen Zn2+ wurden innerhalb von vier Stunden freigesetzt. Extrazellulär frei gesetzte Zn2+ sind in der Lage toxische Effekte hervor zu rufen, wie Versuch mit Zinkchlorid (ZnCl2) zeigen konnten. Gleichzeitig beruht die Toxizität von ZnO NP jedoch nicht allein auf der Freisetzung von Zn2+, vielmehr ist auch eine direkte Interaktion der Nanopartikel mit humanen Tumorzellen vonnöten. Wir konnten zeigen, dass es mit Hilfe einer Silikahülle (ZnO@SiO2 NP) möglich ist, die Freisetzung von Zn2+ aus den Partikeln zu verzögern, sodass ein sicherer Transport im Blutgefäßsystem möglich wäre. Zudem könnte mit Hilfe von speziellen Liganden ein gezieltes Ansteuern des Tumors im menschlichen Körper erfolgen. Wir konnten nachzuweisen, dass ZnO@SiO2 NP innerhalb von vier Stunden auf der Membran verschiedener Tumorzellen zu liegen kamen und von diesen aufgenommen wurden. Dies zeigt, dass die Synthese solcher Partikel im Prinzip möglich ist, allerdings braucht das System noch weiteren Feinschliff. Um die Toxizität im Körper optimal kontrollieren zu können, ist es enorm wichtig zu wissen, auf welche Weise Zellen mit den Nanopartikeln interagieren und wie toxische Effekte zustande kommen. Mit verschiedenen Tumorzelllinien konnten wir zeigen, dass sowohl nekrotischer als auch apoptotischer Zelltod vermittelt werden können. In einem einfachen Experiment mit Plasmid-DNA in einer zellfreien Umgebung konnte gezeigt werden, dass ZnO NP in der Lage sind, Einzelstrangbrüche der DNA zu induzieren und, dass zusammen mit H2O2 als repräsentativer Vertreter von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auch Doppelstrangbrüche entstehen, die über den alleinigen Effekt von H2O2 deutlich hinaus gehen. Somit sind ZnO NP auch in der Lage Tumorzellen über die DNA zu schädigen. Es ist wohlbekannt, dass die Entstehung von ROS an der Toxizität von ZnO NP beteiligt ist, jedoch ist es Gegenstand von Diskussionen ob die ROS direkt an der Oberfläche der Partikel entstehen oder erst bei Interaktion mit einem biologischen System. Für die hier verwendeten ZnO NP konnten wir nachweisen, dass ROS nicht direkt an den Nanopartikeln entstehen, die Inkubation mit ZnO NP konnte jedoch das Superoxid-Level in den Mitochondrien anheben und zu einer Freisetzung von Cytochrom C führen. Dies deutet darauf hin, dass sowohl ROS als auch eine Schädigung der Mitochondrien eine zentrale Rolle im Toxizitätsmechanismus von ZnO NP spielen. Das Auslösen von Apoptose über den intrinsischen Weg über die Mitochondrien ist denkbar sowie eine Vermittlung des Tumorzelltods über die oben genannten DNA-Schäden. Um zu untersuchen, ob ZnO NP eine selektive Toxizität gegenüber Tumorzellen aufweisen wurden die Effekte der Nanopartikel auf Tumorzellen mit jenen auf Fibroblasten und endotheliale Zellen verglichen. Bei einer mittleren Konzentration von 50 µg/mL ZnO NP wurden zwar die Fibroblasten weniger geschädigt als die Tumorzellen, jedoch reagierten die endothelialen Zellen sehr empfindlich. Dies zeigt, dass für eine sichere Anwendung der Nanopartikel auf jeden Fall eine entsprechende Hülle vonnöten ist, um die Partikel im Blutgefäßsystem transportieren zu können, sowie um ein aktives Targeting zum Tumor zu ermöglichen. Nicht nur als alleinstehendes Tumortherapeutikum sind ZnO NP denkbar, sondern auch in Kombination mit Strahlentherapie. Hier konnten wir zeigen, dass die Nanopartikel in der Lage sind den Erfolg der Radiotherapie zu verbessern, was besonders im Licht von häufig während der Therapie entstehenden Strahlenresistenzen interessant ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass viele Details des Toxizitätsmechanismus von ZnO NP aufgedeckt werden konnten. Dies ist wichtig um diese Nanopartikel in der Zukunft sicher als innovatives Therapeutikum einsetzen zu können.Currently, nanomedicine is a hot topic in the development of new therapeutic agents and great hopes have been placed on nanoparticulate formulations to revolutionise tumor therapy. However, risk assessment in the field of nanomedicine constitutes a major challenge since completely new interactions between the therapeutic agent and the human body must be considered. The aim of this study was to unveil the concepts underlying the toxicity of zinc oxide nanoparticles (ZnO NP) to be able to precisely control their behaviour in an in vivo setting and thus paving the way for their application as innovative anti-tumor agent. The work with ZnO NP and zinc ions released by them is particularly challenging since metal ions intervene with many signalling pathways and can elicit toxicities via a multitude of mechanisms. We used ZnO NP of spherical shape with a size of 5–22 nm and a zeta potential of +20–30 mV. They readily formed agglomerates in aqueous solution, and they were prone to dissolution. About one fourth of the contained amount of zinc ions may be released extracellularly. Experiments with ZnCl2—as representative of the extracellularly released zinc ions—showed that zinc ions can exert cytotoxicity once the buffer capacity of the cell culture medium is exhausted. The cytotoxicity of ZnO NP was not only attributable to the extracellular release of zinc ions but rather additionally to direct interaction with the nanoparticulate matter. Enclosing zinc oxide nanoparticles into a silica shell (ZnO@SiO2 NP) served the triple purposes of preventing them from premature dissolution, enabling the attachment of targeting moieties, and tracking the nanoparticles via incorporated dyes. Experiments with ZnO@SiO2 NP showed attachment of the particles to the outer membrane of different tumor cells as well as uptake within four hours. Additionally, the silica coating delayed onset of cytotoxicity. This shows that nanoparticles with these favourable properties are technically possible, even though requiring further fine-tuning. It is of great importance to understand the cellular reactions to treatment with ZnO NP to optimally control their toxicity in the human body. We found that ZnO NP were able to convey apoptotic and necrotic cell death to different human tumor cells. An experiment with plasmids as DNA representatives in a cell-free environment showed that ZnO NP were able to induce single strand breaks (SSB) of the DNA. Together with H2O2 as a representative reactive oxygen species (ROS) they additionally induced huge amounts of double strand breaks (DSB), which surpassed the effect of treatment with H2O2 alone. ROS generation is a well-established part of the mechanism of ZnO NP’s cytotoxicity. However, there are still ongoing debates on whether ROS are generated directly on the surface of ZnO NP or whether they are triggered intracellularly. We showed that the ZnO NP used in this study were not able to generate ROS at their surface, but they did elevate superoxide levels in the mitochondria. Furthermore, we showed that mitochondria release cytochrome c upon treatment. Thus, damaging of the mitochondria and generation of ROS are most likely central elements of the toxicity of ZnO NP. Induction of apoptosis may occur via the mitochondrial signalling pathway. Alternatively, also above-mentioned DNA damage may play a role in induction of apoptosis. To test for tumor-specific toxicity, we treated A549 tumor cells as well as non-malignant fibroblasts and endothelial cells with ZnO NP of different concentrations. Treatment with an intermediate concentration of 50 µg/mL revealed that fibroblasts were less affected by the treatment compared to tumor cells, but endothelial cells reacted very sensitive. Thus, treatment with ZnO NP is a double-edged sword. This means we need to prevent premature dissolution of ZnO NP in the bloodstream and add active targeting to the NP, to safely direct them to the tumor. ZnO NP are discussed as a stand-alone treatment against cancer and as adjuvant for other therapies, for example radiotherapy. We were able to show that ZnO NP in combination with irradiation significantly reduced tumor cell survival. This demonstrates the potential of ZnO NP to improve the radiotherapeutic outcome. We unveiled some details of the toxicity mechanism of ZnO NP. It is of great importance to truly understand the interaction between these nanoparticles and human cells in order to be able to safely apply them in an in vivo setting. Nanoparticulate anti-tumor agents such as ZnO NP have the potential to overcome current therapeutic hurdles in tumor treatment.