Synthesis and studies of the antitumor activity of ruthenium-salen complexes.

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaO cancro da mama e o cancro colorretal são, respetivamente, o segundo e terceiro tipos de cancro com maior incidência e, por isso, estão associados a elevadas taxas de mortalidade em todo o mundo. Embora exista uma série de fármacos quimioterapêu-ticos usados para o tratamento destas doenças, que incluem os complexos metálicos de platina, as fluoropirimidinas, os taxanos, as antraciclinas, entre outros, de uma for-ma geral eles apresentam algumas desvantagens. Entre elas, destacam-se os efeitos adversos severos, bem como o desenvolvimento de resistência aos fármacos por parte das células tumorais ao longo da terapêutica. Assim, é fundamental o desenvolvimento de novos fármacos antitumorais que ultrapassem estes problemas. Estudos anteriores demonstraram que complexos metálicos salen derivados do ácido (+)-canfórico exibem atividade antitumoral, especialmente complexos metálicos com ligandos di e tetraclorados. Segundo a literatura, complexos de ruténio têm apresen-tado elevada atividade citotóxica, demonstrando maior seletividade para as células tumorais. A sua menor toxicidade relativamente, por exemplo, aos complexos de pla-tina, torna-os uma alternativa credível e promissora aos fármacos atualmente utiliza-dos em quimioterapia. Neste enquadramento, o objetivo do trabalho descrito nesta dissertação foi sintetizar novos complexos de Ru(III) e Ru(II), com ligandos salen e salan, di e tetraclorados derivados do ácido (+)-canfórico e, recorrendo a estudos in vitro, testar a sua atividade antitumoral em linhas celulares de cancro da mama, MCF-7 e HCC1806, e colorretal, LS1034 e WiDr. A finalidade deste estudo passa por perceber se o número de átomos de cloro, o número de oxidação do metal e/ou as alterações no esqueleto do ligando (ligando salen ou salan) influenciam a atividade citotóxica do complexo. Na primeira parte do trabalho foi efetuada a síntese dos complexos de ruténio deriva-dos do ácido (+)-canfórico. Esta síntese envolveu inicialmente a preparação da dia-mina derivada do ácido (+)-canfórico pela reação de Schmidt. Depois, a reação da dia-mina com derivados de salicilaldeído sob irradiação por ultrassons, originou os ligan-dos salen. Uma vez obtidos os ligandos salen, os mesmos foram reduzidos para obter os correspondentes ligados salan. Para finalizar, os ligandos salen e salan foram com-plexados com Ru(III) e Ru(II), dando origem aos respetivos complexos de ruténio. A segunda parte do trabalho envolveu a análise da atividade antitumoral dos comple-xos de ruténio sintetizados, nas linhas celulares de cancro da mama, MCF-7 e HCC1806, e colorretal, LS1034 e WiDr, através de estudos in vitro. Primeiro avaliou-se a atividade antiproliferativa de todos os complexos, e observou-se que todos apresen-tavam atividade antiproliferativa dependente da concentração de compostos, nas linhas celulares em estudo. No entanto, o complexo mais promissor foi o complexo de Ru(III) do ligando salen tetraclorado, com valores de IC50 que compreendem 2,1-3,7 M. A atividade antiproliferativa promissora deste composto pode ser devida à presença, em simultâneo, de duas características relevantes, a pre-sença dos quatro átomos de cloro, responsáveis por aumentar a lipofilicidade do com-plexo e, consequentemente, a sua captação pela célula tumoral, e o número de oxida-ção +3, que permite que estes complexos atuem como profármacos. Com este complexo mais promissor, prosseguiram os estudos de viabilidade e ciclo celular, nos quais se observou uma diminuição da viabilidade celular para todas as linhas celulares, sendo esta mais marcada nas linhas HCC1806 e LS1034, acompanhada de notória morte celular por necrose para a concentração mais elevada e de morte celular por apoptose para a concentração intermédia. Avaliou-se também o stresse oxidativo induzido nas células pelo complexo, através da avaliação da produção de ROS e da defesa antioxidante GSH. Os resultados indicam que houve alterações a nível de stresse oxidativo, nomeadamente na produção intracelular de peróxidos e superóxidos, e que esta alteração está muito provavelmente relacionada com o tipo de morte celular induzida pelo complexo. Realizaram-se ainda estudos de seletividade com recurso a duas linhas celulares de tecido saudável: HFF1 e CCD841 CoN. Observou-se que o complexo mais promissor apresentou elevada seletividade para linhas celulares tumorais, visto que não diminuiu de forma considerável a viabilidade das células não tumorais. Para concluir os estudos, avaliou-se a hemocompatibilidade do complexo, por quantificação da hemoglobina libertada. Os resultados revelaram que o complexo não afeta a integridade da membrana dos eritrócitos, facto suportado pela reduzida libertação da hemoglobina para o soro. Com base nos resultados obtidos, o complexo de Ru(III) tetraclorado salen demonstrou possuir características que o poderão tornar uma alternativa eficaz e segura para o tratamento do cancro da mama e colorretal.Breast cancer and colorectal cancer are, respectively, the second and third most prevalent cancers, and are therefore associated with high mortality rates worldwide. Although there are a number of chemotherapeutic drugs used for the treatment of these diseases, which include platinum metal complexes, fluoropyrimidines, taxanes, anthracyclines, among others, they generally have some disadvantages. These include severe adverse effects as well as the development of resistance to the drugs by the tumor cells throughout the therapy. Thus, the development of new antitumor drugs that will overcome these problems is fundamental.Previous studies showed that metal complexes derived from (+)-camphoric acid exhibit antitumor activity, especially metal complexes with di-and tetrachlorinated ligands. According to the literature, ruthenium complexes have shown high cytotoxic activity, demonstrating greater selectivity for tumor cells. Their lower toxicity relatively to, for example, platinum complexes makes them a credible and promising alternative to currently used chemotherapy drugs. In this context, the objective of the work described in this dissertation was to synthesize new Ru(III) and Ru(II) complexes with di- and tetrachlorinated salen and salan ligands and, using in vitro studies, test their antitumor activity in breast cancer MCF-7 and HCC1806 cell lines, and in colorectal cancer LS1034 and WiDr cell lines. The purpose of this study is to determine whether the number of chlorine atoms, the oxidation number of the metal and / or changes in the backbone of the ligand (salen or salan ligand) influence the cytotoxic activity of the complex. In the first part of the work the synthesis of ruthenium complexes derived from cam-phoric acid was carried out. This synthesis initially involved the preparation of the diamine derived from (+)-camphoric acid through the Schmidt reaction. The subse-quent reaction of the diamine with salicylaldehyde derivatives under ultrasound irradi-ation gave the salen ligands. These ligands were reduced to give the corresponding salan ligands. Finally, the salen and salan ligands were complexed with Ru(III) and Ru(II), giving rise to the corresponding ruthenium complexes. The second part of the work involved the analysis of the antitumor activity of the ru-thenium complexes that were synthesized, in the breast cancer cell lines, MCF-7 and HCC1806, and colorectal cancer cell lines LS1034 and WiDr, by in vitro studies. The antiproliferative activity of all the complexes was first evaluated and all of them showed antiproliferative activity in the cell lines under study, dependent on the con-centration of compounds. However, the most promising complex was the Ru(III) com-plex of the tetrachlorinated salen ligand, with IC50 values of 2.1-3.7 μM. It is very im-portant to note that these values are lower than many of those obtained with drugs currently used in the chemotherapeutic treatment of breast and colorectal cancers. The promising antiproliferative activity of this compound can be due to the simultane-ous presence of two relevant characteristics, the presence of the four chlorine atoms, responsible for increasing the lipophilicity of the complex and, consequently, its uptake by the tumor cell, and the oxidation number +3, which allows these complexes to act as prodrugs. With this most promising complex, viability and cell cycle studies were undertaken, in which a decrease in cell viability was observed for all cell lines, which was more marked in the HCC1806 and LS1034 cell lines, accompanied by cell death by necrosis for the highest concentration and cell death by apoptosis for the intermediate concen-tration. The oxidative stress induced in the cells by the complex, was also determined through the evaluation of ROS production and GSH antioxidant defense. The results indicate that there were alterations in oxidative stress, namely in the intracellular pro-duction of peroxides and superoxides, and that this alteration is most probably related to the type of cell death induced by the complex. Selective studies were also performed using two healthy tissue cell lines: HFF1 and CCD841 CoN. It was observed that the most promising complex showed high selectivity for tumor cell lines, since it did not significantly decrease the viability of non-tumor cells.To conclude the studies, the hemocompatibility of the complex was assessed by quantifying the released hemoglobin. The results revealed that the complex does not affect the erythrocyte membrane integrity, supported by the reduced release of he-moglobin to the serum. Based on the results obtained, the tetrachlorinated salen Ru(III) complex has been shown to have characteristics that may make it an effective and safe alternative for the treatment of breast and colorectal cancer