Metabolismo como alvo terapêutica na leucemia mieloide aguda - Glicólise ou Fosforilação oxidativa

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaAs células tumorais necessitam de alterar o seu metabolismo de forma a conseguirem manter taxas elevadas de crescimento e proliferação. Uma das alterações metabólicas mais frequentes nas células tumorais é o efeito de Warburg. Nesta situação, as células tumorais alteram o seu metabolismo de oxidação fosforilativa (OXPHOS) para glicólise, independentemente da presença de oxigénio. Na glicólise as células obtêm menos ATP por molécula de glicose. Desta forma as células aumentam a taxa glicolítica, o consumo e transportadores de glicose (GLUTs), a fermentação de lactato assim como as enzimas glicolíticas, como as hexocinases. Este é um processo regulado que tem como principais responsáveis o HIF-1, o p53 e o MYC. Neste sentido, as alterações metabólicas podem constituir um novo alvo terapêutico no cancro, como a leucemia mieloide aguda (LMA). Nesta patologia já se encontram descritas mutações em genes do metabolismo, nomeadamente no isocitrato desidrogenase 1/2 (IDH1/2). A LMA é uma neoplasia hematológica heterogénea caracterizada por bloqueio da diferenciação mieloide e proliferação de progenitores mieloides que se acumulam na medula óssea e no sangue. Esta neoplasia continua a ser uma doença com prognóstico variado e com elevada taxa de mortalidade. Assim, este estudo pretendeu caracterizar metabolicamente linhas celulares de LMA e avaliar o potencial da glicólise e da OXPHOS como alvos terapêuticos nestes modelos in vitro. Para tal, estudaram-se quatro linhas celulares de subtipos diferentes de LMA: K 562, uma linha celular de eritroleucemia com o gene de fusão BCR-ABL1; KG 1, uma linha celular de eritroleucemia com os genes de fusão FGFR1 e FGFR1OP2 ; NB 4, uma linha celular de leucemia promielocítica aguda com o gene de fusão PML-RARA; THP 1, uma linha de leucemia monocítica aguda com o gene de fusão KMT2A-MLLT3. A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas através do teste de exclusão do azul de tripano. A deteção de mutações no exão 4 dos genes IDH1/2 foi efetuada por sequenciação de Sanger. Os níveis intracelulares de peróxidos e de anião superóxido e o potencial membranar mitocondrial foram analisados por fluorimetria com recurso às sondas fluorescentes, DCFH2-DA, DHE e JC-1, respetivamente. Para avaliar o efeito da inibição da glicólise e da OXPHOS, as células foram incubadas na presença e na ausência de 2 desoxi d glicose (2-DG; inibidor da glicólise) ou de oligomicina (oligo; inibidor da OXPHOS). A atividade metabólica foi avaliada através do ensaio metabólico com resazurina e a morte celular por citometria de fluxo usando dupla marcação de Anexina V e 7-AAD. O ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo, usando iodeto de propídeo/RNase. A captação de glicose foi medida através da captação de 18F-FDG e os níveis de expressão de 8 genes que codificam os GLUTs, SLC2A, 2 hexocinases e HIF-1α foram avaliados por RT-PCR. Os resultados mostraram que a linha celular NB-4 apresenta a maior captação de 18F-FDG e a THP-1 a menor, apesar de ser a única em que se encontravam expressos todos os genes testados. As células NB-4 apresentaram os níveis mais elevados de peróxidos e anião superóxido. As linhas celulares K-562 e KG-1 apresentam captação de 18F-FDG semelhante assim como peróxidos e anião superóxido. Nestas linhas foi ainda encontrada uma variante sinónima no exão 4 da IDH1 em heterozigotia. A inibição da glicólise induziu diminuição da atividade metabólica de forma dependente da dose e da linha celular, sendo a linha celular KG-1 a mais sensível. A inibição da OXPHOS também diminuiu a atividade metabólica de forma dependente da linha celular. Neste caso, as células K-562 foram as mais sensíveis. As células THP-1 são as mais resistentes a ambos os compostos. Estes compostos induziram morte celular, principalmente por apoptose, e bloqueio do ciclo celular em fase G0/G1. No entanto, a 2-DG apresentou um efeito citotóxico, principalmente, nas linhas K-562 e NB-4, e um efeito citostático mais evidente nas KG-1 e THP-1. Por outro lado, a oligomicina induziu sobretudo morte celular nas linhas K-562 e KG-1 e bloqueio do ciclo celular nas NB-4, THP-1 e K-562. A inibição da glicólise diminuiu a captação de 18F-FDG, principalmente nas linhas celulares KG-1 e NB-4, aumentou a expressão de SLC2A11 e diminuiu a expressão de HK1. A inibição da OXPHOS aumentou a captação de 18F-FDG, especialmente nas K-562, e aumentou a expressão dos genes SLC2A1 e HK2. Em conclusão, os resultados sugerem que o metabolismo celular poderá ser um alvo terapêutico na LMA. No entanto, as linhas celulares de LMA são metabolicamente diferentes, sendo as KG-1 e as NB-4 as células mais glicolíticas. Por outro lado, as K-562 aparentam ser mais dependentes da OXPHOS e as THP-1 parecem ser independentes desta via metabólica. Perante a inibição da OXPHOS as células parecem reprogramar o metabolismo celular de modo a obter energia por outra via metabólica, o que sugere que a glicólise poderá ser um melhor alvo terapêutico na LMA.To sustain the high levels of growth and proliferation, cancer cells need to alter their metabolic program. One of the most common metabolic alterations observed in cancer cells is the Warburg effect, where cancer cells shift their metabolism from oxidative phosphorylation (OXPHOS) to glycolysis, regardless of the presence of oxygen. Shifting from OXPHOS to glycolysis results in lower ATP production. Therefore, this alteration is associated with enhanced glycolytic rates, increased glucose uptake, through glucose transporters (GLUTs), and lactate fermentation as well as upregulation of glycolytic enzymes, such as hexokinases. The metabolic shift is a regulated process with HIF-1, p53 and MYC as the main responsible. Therefore, metabolic reprogramming may constitute a new molecular target for cancer therapy, namely in acute myeloid leukemia (AML) where mutations in metabolism genes, such as isocitrate dehydrogenase 1/2 (IDH1/2), were already describe. AML is a heterogeneous hematologic neoplasia characterized by myeloid differentiation arrest and uncontrolled proliferation of abnormal myeloid progenitors that accumulate in the bone marrow and blood. Despite the progress made, AML still has a variable prognosis and high mortality rate. Therefore, the aims of this study were to metabolically characterize AML cell lines and assess the potential of glycolysis and OXPHOS metabolism as a therapeutic target in AML in these in vitro models. To this end four AML cell lines of different subtypes were used: K-562, an erythroleukemia cell line carrying BCR-ABL1 fusion gene; KG-1, an erythroleukemia cell line with FGFR1 and FGFR1OP2 fusion genes; NB-4, an acute promyelocytic leukemia cell line with PML-RARA fusion gene; THP-1, an acute monocytic leukemia cell line carrying KMT2A-MLLT3 fusion gene. Trypan blue exclusion test was used to evaluate cell viability and proliferation. The presence of IDH1/2 exon 4 mutations was assessed using sanger sequencing. Intracellular peroxides and superoxide anion levels as well as mitochondrial membrane potential were measured by fluorimetry using DCFH2-DA, DHE and JC-1 florescent probes, respectively. To evaluate the effects of glycolysis and OXPHOS inhibition cells were incubated in the presence or absence of 2-deoxy-D-glucose (2-DG; glycolysis inhibitor) or oligomycin complex (oligo; OXPHOS inhibitor). Metabolic activity was assessed by resazurin assay and cell death was determined by flow cytometry using Annexin V and 7-AAD double staining. Cell cycle was also assessed by flow cytometry, using propidium iodide/RNAse. Additionally, glucose intake was measured by 18F-FDG uptake and expression levels of 8 SLC2A (genes that encode GLUTs), 2 hexokinases and HIF-1α were assessed using RT-PCR. The results showed that NB-4 cell line has the highest 18F-FDG, whereas THP-1 cells showed the lowest uptake. NB-4 cell line also had the highest peroxide and superoxide anion levels. THP 1, unlike the remaining cell lines, expressed the 8 SLC2A genes tested. K-562 and KG-1 cell lines had similar 18F-FDG uptake values, ROS levels and IDH1 genotype (the single nucleotide variant rs11554137 in heterozygosity in exon 4). Glycolysis inhibition reduced metabolic activity in a dose- and cell line dependent manner. KG-1 cell line was the most sensitive. OXPHOS inhibition also led to a decrease in metabolic activity, in a cell line-dependent manner. K-562 cells were the most sensitive ones to this inhibition. THP-1 cell line was the most resistant to these two compounds. Both inhibitions appeared to induce cell death, mainly by apoptosis, and cell cycle arrest in G0/G1 phase. 2-DG treatment had a more evident cytotoxic effect on K-562 and NB-4 and a cytostatic effect on KG-1 and THP-1 cell lines. On the other hand, oligomycin induced mainly a cytotoxic effect on K-562 and KG-1 cells and a cytostatic effect on NB-4, THP-1 and K 562. Glycolysis inhibition led to a decrease of 18F-FDG uptake, mainly in KG-1 and NB-4 cell lines, as well as to an increase of SLC2A11 and decrease of HK1 gene expression levels. Lastly, OXPHOS inhibition increased 18F-FDG uptake, particularly in K-562 cells, SLC2A1 and HK2 expression levels. In conclusion, the results suggest that cellular metabolism may be a therapeutic target in AML. However, AML cell lines have different metabolic preferences, with KG-1 and NB-4 cell lines appearing to be more glycolytic, whereas K 562 appears to be more dependent on OXPHOS. In contrast, THP-1 cell line does not appear to be dependent on OXPHOS. These cell lines seem to reprogram their metabolism in order to overcome the OXPHOS inhibition, suggesting that glycolysis is a better therapeutic target in AML