Antimicrobial resistance profile of Helicobacter pylori

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaHelicobacter pylori uma bactéria gram negativa responsável pela colonização do epitélio gástrico, sendo globalmente o agente infecioso com maior incidência. Devido ao aumento da resistência aos antibióticos desta bactéria e à gravidade dos sintomas apresentados, originando o aparecimento úlceras gástricas, linfomas gástricos do tipo MALT e ainda adenocarcinomas gástricos, e também de acordo com o Relatório de Consenso de Maastricht III, foram desenvolvidas terapias visando a erradicação da mesma. Os objetivos deste estudo prendem-se na determinação do perfil de resistência de Helicobacter pylori aos principais antibióticos, pela deteção de mutações nos genes 23S rRNA peptidiltranferase, gyrA e rdxA, traçando assim um perfil epidemiológico da resistência antimicrobiana da mesma, como também na deteção da bactéria em diferentes tipos de águas usadas para consumo humano.A identificação da presença de Helicobacter pylori foi feita em biopsias gástricas de 33 doentes, procedendo-se ao uso da técnica de PCR em tempo real, dos quais 22 tiveram resultados positivos para a presença da bactéria. Nessas amostras, foi realizada a deteção e caracterização dos genes 23S rRNA peptidiltranferase, gyrA e rdxA, que conferem resistência à claritromicina, às fluoroquinolonas e ao metronidazol, respetivamente por PCR em tempo real usando primers específicos. A sequência nucleotídica dos amplificados obtidos foi conseguida através da purificação e sequenciação da banda de DNA excisado do gel de eletroforese. As sequências geradas foram comparadas com a estirpe tipo Helicobacter pylori 26695, identificando as respetivas mutações.Os resultados obtidos mostraram que, relativamente, aos principais antibióticos existem uma diminuição da prevalência das mutações previamente descritas e o aparecimento de novas mutações. Referente ao caso da claritromicina, houve o aparecimento de novas mutações, encontrando-se nas posições 2324, 2344, 2365 e 2379. No caso das fluoroquinolonas, verifica-se uma grande prevalência de novas mutações sendo estas as mutações 191, 199 e 208. O metronidazol é o antibiótico que apresenta mais mutações, muitas delas já descritas. Em suma, verifica-se a existência de várias mutações para os antibióticos, usados no tratamento de Helicobacter pylori, no entanto, o seu papel na interação entre a bactéria e o antibiótico ainda é desconhecido. Quanto à deteção de Helicobacter pylori em água foram analisadas 34 amostras e, em 8 delas pode-se verificar a presença de Helicobacter pylori, podendo assim concluir-se que a água, pode ser um meio para uma transmissão da bactéria.Posto isto, este trabalho, demonstra que é necessário perceber a evolução de Helicobacter pylori, de modo a conhecer as mutações presentes no seu genoma, para que seja escolhido e administrado um antibiótico que permita uma erradicação eficaz da bactéria.Helicobacter pylori is a gram negative bacteria responsible for the colonization of gastric epithelium, being globally the infectious agent with the highest incidence. Due to the increased antibiotic resistance of this bacterium and the severity of the symptoms presented, resulting in the onset of gastric ulcers, MALT gastric lymphomas and even gastric adenocarcinomas, and also according to the Maastricht consensus report III, therapies have been developed to eradicate this infection. The objectives of this study are the determination of the resistance profile of Helicobacter pylori to the main antibiotics, through the detection of mutations in the genes 23S rRNA peptidiltranferase, gyrA and rdxA, thus tracing an epidemiological profile of the antimicrobial resistance, as well as in the detection of bacteria in different types of water used for human consumption.The identification of the presence of Helicobacter pylori was done in gastric biopsies of 33 patients, using the real-time PCR technique, of which 22 were positive for the presence of the bacterium. In these samples, the detection and characterization of the genes 23S RRNA peptidiltranferase, gyrA and rdxA, which confer resistance to clarithromycin, fluoroquinolones and metronidazole, respectively, was performed by real-time PCR using specific primers. The nucleotide sequence of the amplified fragments was achieved through the purification and sequencing of the DNA band excised from the electrophoresis gel. The sequences generated were compared with the type strain Helicobacter pylori 26695, identifying the respective mutations.The results showed that, with regard to the main antibiotics there is a decrease in the prevalence of the previously described mutations and the emergence of new mutations. Concerning the case of the clarithromycin, there were the emergence of new mutations, at the positions 2324, 2344, 2365 and 2379. In the case of fluoroquinolones, a great prevalence of new mutations was found, being these mutations 191, 199 and 208. Metronidazole is the antibiotic that presents more mutations, many of them already described. In short, we observe the existence of several mutations for antibiotics, used in the treatment of Helicobacter pylori, however, its role in the interaction between the bacterium and the antibiotic is still unknown. As for the detection of Helicobacter pylori in water, 34 samples were analyzed and, in eight of them, the presence of Helicobacter pylori was verified, and it can be concluded that the water can be a transmission route for the bacterium.In conclusion, this work shows that it is necessary to understand the evolution of Helicobacter pylori, in order to know the mutations present in its genome, in order to be chosen and administered an antibiotic that allows the effective eradication of the bacterium