Study of the protective effects of GLP-1R agonists on diabetic retinopathy

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA retinopatia diabética é uma das principais causas de perda de visão, incluindo cegueira, em indivíduos diabéticos em idade ativa, nos países desenvolvidos. Atualmente, os tratamentos disponíveis para a retinopatia diabética são direcionados para as fases mais avançadas da doença, em que a visão já se encontra comprometida. Estes tratamentos são invasivos, não sendo eficazes para todos os doentes, e possuem vários riscos associados, nomeadamente o de infeções como a endoftalmite infeciosa e o risco de descolamento da retina. Além disso, a adoção destes tratamentos permite apenas retardar a progressão da doença e não a sua cura. Neste sentido é importante que sejam desenvolvidas e implementadas estratégias terapêuticas direcionadas para as fases mais iniciais da retinopatia diabética, em que os processos sejam reversíveis e que seja possível prevenir a perda de visão. As terapias antidiabéticas baseadas nas incretinas são divididas em duas classes: os inibidores da enzima dipeptidil-peptidase-4 (DPP-4) e os agonistas do recetor do peptídeo semelhante ao glucagão (GLP-1R). Ambas visam o aumento do tempo de meia-vida da hormona incretina GLP-1 em circulação (composto importante para a manutenção da homeostase da glicose). A administração destes fármacos melhora o controlo glicémico através do aumento de produção e secreção de insulina em doentes com diabetes tipo 2. Estudos anteriores do nosso grupo mostraram que a sitagliptina, que é um inibidor da DPP-4, tem efeitos pleiotrópicos, prevenindo a inflamação e a apoptose das células da retina e exercendo um efeito benéfico na integridade da barreira hemato-retiniana (BHR) em modelos animais de diabetes, tanto do tipo 2 (DMT2) como do tipo 1 (DMT1). Ainda, estudos mais recentes do grupo mostraram que a Exendina-4 (Ex-4), um agonista do GLP-1R, previne a rutura da BHR e a inflamação na retina, através da inibição de citocinas inflamatórias pelas células da microglia, num modelo animal de lesão retiniana por isquémia-reperfusão (IR), que mimetiza as principais características da retinopatia diabética (neurodegenerescência, neuroinflamação e aumento da permeabilidade da BHR). Este trabalho teve como objetivo avaliar os potenciais efeitos benéficos dos agonistas do GLP-1R na retina diabética, por um mecanismo independente do aumento da produção e secreção de insulina. Para tal utilizou-se um modelo animal de diabetes do tipo 1, com diabetes induzida por streptozotocina e estudou-se o efeito de dois agonistas do GLP-1R, o liraglutido e a Ex-4. Mais especificamente, avaliou-se o potencial efeito protetor destes agonistas na rutura da BHR, bem como de que forma estes compostos modulam a reatividade das células da microglia. Este aspeto foi avaliado em termos da sua capacidade migratória nas camadas da retina e das suas alterações morfológicas.O tratamento com liraglutido (200 µg/Kg/2x dia) foi iniciado duas semanas após a indução da diabetes e prolongou-se por mais duas semanas, não se tendo verificado nenhuma alteração no peso e nos níveis de glicémica e hemoglobina glicosilada dos animais diabéticos tratados com o fármaco, comparativamente com os animais diabéticos. O liraglutido preveniu o aumento da permeabilidade da BHR, induzido pela diabetes, bem como as alterações nos níveis das proteínas das junções oclusivas (claudina-5 e ocludina). Além disso, verificou-se que este agonista do GLP-1R modula a capacidade migratória das células da microglia na retina, induzida pela diabetes. O tratamento com a Ex-4 (10 µg/Kg/2x dia) foi iniciado uma semana após a indução da diabetes, tendo-se prolongado por mais três semanas. A Ex-4 não teve qualquer efeito nos níveis de insulina dos animais diabéticos. Os resultados obtidos mostraram que a Ex-4 previne a rutura da BHR e que este fármaco tem um efeito anti-inflamatório nas retinas de ratos diabéticos, através da inibição de citocinas pró-inflamatórias, prevenindo o aumento dos níveis da molécula de adesão molecular (ICAM-1). A Ex-4 mostrou, ainda, que tem a capacidade não só de prevenir a alteração da distribuição das células da microglia, nas diferentes camadas da retina, como também previne as alterações morfológicas destas células, induzidas pela diabetes.Na sequência de um estudo anterior do grupo, este trabalho vem reforçar a ideia de que os agonistas do GLP-1R, liraglutido e Ex-4, conseguem prevenir a rutura da BHR por diminuição do estado pró-inflamatório via inibição da reatividade das células da microglia da retina.Diabetic retinopathy is one of the leading causes of vision loss, in developing-age diabetic individuals, in developed countries. Currently, the treatments available for diabetic retinopathy are against to the advanced stages of the disease, where vision is already compromised. These treatments are invasive and not effective for all patients and have several associated risks, namely infections such as endophthalmitis, and the risk of retinal detachment. In addition, they only delay the progression of the disease, being not able to healing it. In this sense, it is important to develop new therapeutic strategies directed to the earliest stages of diabetic retinopathy, in which the processes are reversible, and could prevent the loss of vision.Incretin-based antidiabetic therapies are divided into two classes: dipeptidyl peptidase-4 inhibitors (DPP-4) and glucagon-like peptide receptor agonists (GLP-1R). Both aim to increase the half-life of the circulating incretin hormone GLP-1 (which is an important compound for the maintenance of glucose homeostasis). Administration of these drugs improves glycemic control by increasing insulin production and secretion in patients with type 2 diabetes. Previous studies in our group have shown that sitagliptin, which is a DPP-4 inhibitor, has pleiotropic effects, preventing inflammation and apoptosis of retinal cells and exerting a beneficial effect on the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in animal models type 2 (T2DM) and type 1 (T1DM) of diabetes. Furthermore, recent studies of the group have shown that Exendin-4 (Ex-4), a GLP-1R agonist, prevents BRB rupture and inflammation in the retina by inhibiting inflammatory cytokines by microglial cells in an ischemia-reperfusion animal model (IR), which mimics the main features of diabetic retinopathy (neurodegeneration, neuroinflammation and increased permeability of BRB).This work aimed to evaluate the potential beneficial effects of GLP-1R agonists on the diabetic retina, by an independent mechanism of increased insulin production and secretion. For this purpose, an animal model of type 1 diabetes with streptozotocin-induced diabetes was used and the effect of two GLP-1R agonists, liraglutide and Ex-4, was evaluated. More specifically, the potential protective effect of these agonists on the breakdown of BHR was evaluated, as well as how these compounds modulate the reactivity of microglial cells. This aspect was evaluated in terms of its migratory capacity in the different layers of the retina as well as morphological changes.Treatment with liraglutide (200 μg/kg/2x day) started two weeks after the induction of diabetes and lasted for two more weeks. No changes were observed between diabetic and diabetic treated animals, in terms of body weight, glycemic levels and glycosylated hemoglobin levels. Liraglutide prevented the increase of BHR permeability and changes in occlusive junction protein levels (claudin-5 and occludin), in diabetic animals. In addition, it has been found that this GLP-1R agonist modulates the migratory capacity of the microglial cells in the retina, induced by diabetes.Treatment with Ex-4 (10 μg/kg/ 2x day) was started one week after the induction of diabetes and lasted for another three weeks. Ex-4 had no effect on the insulin levels of diabetic animals. The results showed that Ex-4 prevents the breakdown of BRB and has an anti-inflammatory effect in the retinas of diabetic rats, by inhibiting pro-inflammatory cytokines and preventing the increase of levels of the molecular adhesion molecule (ICAM-1). Ex-4 also has the ability not only to prevent alteration of the distribution of microglia cells in the different layers of the retina, but also to prevent the morphological alterations of these cells, induced by diabetes.Following an earlier study by the group, this work reinforces the idea that GLP-1R agonists, liraglutide and Ex-4, can prevent BRB rupture by decreasing the pro-inflammatory state via inhibition of cell reactivity microglia of the retina