Indução da Apresentação de Antigénios em Células tumorais por Reprogramação Direta.

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA presença de mutações genéticas em células do cancro resulta na produção de antigénios específicos de tumor, que são apresentados no complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I à superfície de células tumorais e por células especializadas em apresentação de antigénios (APCs) no contexto do MHC-I e -II, induzindo uma resposta imunitária antitumoral. No entanto, os tumores podem inibir a resposta imunitária através de diversos mecanismos, como por exemplo, a sub-regulação da expressão de MHC-I à superfície. Na área da imunoterapia oncológica, as atuais estratégias tencionam reiniciar a imunidade tumoral, porém estas apresentam limitações, como o facto de serem não especificas ou necessitarem da identificação de antigénios tumorais. Em reprogramação celular, uma célula é convertida noutra identidade celular. Recentemente, o nosso grupo identificou Fatores de transcrição (FTs) que induzem a conversão de fibroblastos em APCs profissionais, nomeadamente células dendríticas (CDs). Desta forma, o objetivo deste projeto é reprogramar células do cancro em APCs com capacidade para apresentar antigénios tumorais endógenos e consequentemente capazes de induzir uma resposta imunitária antitumoral especifica. Neste estudo, é apresentada uma estratégia para induzir apresentação de antigénios em células de melanoma e cancro do pulmão através da expressão de FTs específicos de células dendríticas (CDs). Os 3 FTs- Pu.1, Irf8 e Batf3 (PIB) foram expressos nas linhas celulares B16 e 3LL por meio de um sistema lentiviral de expressão induzível. Os 3 FTs induziram a expressão do marcador específico de CDs Clec9a e de MHC-I e -II em células tumorais. A adição de citoquinas importantes para o desenvolvimento de CDs e a transdução com novas combinações de FTs levou a um aumento na eficiência da reprogramação. Em células B16 e 3LL que expressam ovalbumina (OVA), a reprogramação para CDs induziu a apresentação de OVA no contexto do MHC-I. Adicionalmente, em células MHC-I/OVA+ foi também detetada a expressão de MHC-II à superfície. Importante, as células transduzidas com os 3 FTs foram capazes de apresentar o antigénio OVA e de ativar um hibridoma de células T CD8+. Estes resultados sugerem que células tumorais reprogramadas adquiriam competência para apresentarem antigénios. Concluindo, este estudo reporta uma estratégia para induzir a conversão direta de células tumorais em APCs que combinem a capacidade de processamento e apresentação de antigénios das CDs com a produção endógena de antigénios. Os resultados gerados abrem caminho para o desenvolvimento de uma futura terapia genética antitumoral.In cancer, genetic mutations result in the production of tumor specific antigens that are presented on Major Histocompatibility Complex (MHC) class I in tumor cells surface and by specialized antigen presenting cells (APCs) on MHC-I and II, mediating anticancer immune responses. However, tumor cells escape immune surveillance through mechanisms that include downregulation of MHC molecules at surface. In cancer immunotherapy, current approaches aim to restore tumor immunity, however they are either nonspecific or demand the complex identification of tumor antigens. Cellular reprogramming refers to the concept of changing the identity of cell towards another cell fate. Recently, our group has shown that three Transcription Factors (TFs) induce dendritic cell (DC) fate (professional APCs) in fibroblasts. Therefore, we aim at directly converting tumor cells into APCs with ability to present endogenous antigens, eliciting specific anticancer adaptive immune responses. Here, I have presented a strategy to induce antigen presentation in mouse melanoma and lung cancer cells through expression of DC-specific TFs. Pu.1, Irf8 and Batf3 (PIB) were expressed in 3LL carcinoma and B16 melanoma cell lines through a reprogramming proven lentiviral inducible expression system. The 3 TFs induced MHC molecules and the expression of the DC-specific marker Clec9a in tumor cell lines. Reprogramming efficiency was increased upon transduction with alternative pools of TFs or addition of cytokines essential for DC-development. In B16 and 3LL cells expressing ovalbumin (OVA), DC reprogramming induced OVA antigen presentation on MHC-I context and cohort of MHC-I/OVA+ B16 derived cells express MHC-II at the cell surface. Remarkably, purified induced MHC-II+ B16-OVA and 3LL-OVA cells were able to activate a CD8+T cell hybridoma expressing a T-cell receptor specific to the MHC-I/OVA complex. These data suggest that reprogrammed tumor cells acquired the competence for antigen presentation. Collectively, this study reports a strategy to directly reprogram tumor cells into an APC-like cell that combine DCs’ antigen processing and presenting abilities with the endogenous production of tumor antigens. These findings pave the way to generate an anticancer gene therapy to restore cancer immune surveillance