Characterization of clinically relevant bacteria by proteotyping

Im Fall von Ausbruchsgeschehen ist die schnelle Identifikation der Infektions- quelle entscheidend. Folglich ist die Typisierung mikrobieller Spezies auch un- terhalb der Spezies- und Subspeziesebene eine wichtige Aufgabe klinisch-mik- robiologischer Labore. Im Rahmen nosokomialer Infektionen ist insbesondere die Differenzierung mikrobieller Subtypen wichtig, die spezifische antimikrobielle Re- sistenzen oder eine erhöhte Humanvirulenz aufweisen. Über die Jahre wurden diverse Subtypisierungsmethoden entwickelt, wobei DNA-Sequenz-basierte Methoden wie die Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) der Goldstandard sind. Nachteile dieser Methoden sind, dass sie entwe- der zeit- und arbeitsintensiv (Sanger Sequenzierung) oder aber kostenintensiv (Next Generation Sequencing) sind. Aus diesem Grund sind sie für die klinische Routinediagnostik nicht optimal, da täglich eine hohe Anzahl von Proben analy- siert werden muss. Neben den sequenzbasierten Methoden hat sich die MALDI-TOF-Massenspek- trometrie zu der Standardmethode für die Genus- und Speziesidentifizierung ent- wickelt, welche auf der Massenbestimmung niedermolekularer, hauptsächlich ri- bosomaler Proteine beruht. Allel-Isoformen dieser ribosomalen Proteine (Bio- markerproteine), die sich in ihrer Masse unterscheiden, bilden die Grundlage ei- nes neuen Typisierungsverfahrens, das initial als Massenspektrometrie-basierte Phyloproteomik (MSPP) bezeichnet, mittlerweile aber in Proteotypisierung um- benannt wurde. Grundlage des Verfahrens ist eine Aminosäuresequenzliste al- leler Isoformen, die aufgrund nicht-synonymer Mutationen in den Genen der Bi- omarkerproteine auftreten und als Massenverschiebungen bei der Überlagerung kalibrierter MALDI-TOF-Spektren sichtbar sind. Auf Basis der detektierbaren Biomarkermassen und Massenverschiebungen kann eine isolatspezifische Kombination von Aminosäuresequenzen abgeleitet werden. Mittels hierarchischer Clusteralgorithmen können, analog zu sequenz- basierten Methoden, phyloproteomische Dendrogramme errechnet werden. Die Proteotypisierung besitzt ein großes Potenzial für die Typisierung von Bak- terien unterhalb der Spezies- und Subspeziesebene, was in dieser Arbeit anhand der Bakterien Campylobacter coli, Campylobacter fetus und Clostridioides diffi- cile demonstriert wird.In case of a disease outbreak fast and reliable detection of the source of infection is crucial. For this reason, typing of microbial species, also at the below-species level is an important task of clinical microbiological laboratories. In the context of nosocomial infections especially differentiation of microbial subtypes with specific antimicrobial resistances and increased human virulence is of importance. Through the years, a wide range of subtyping methods has been developed, whereby DNA sequence-based methods like multilocus sequence typing (MLST) are the current gold standard. The disadvantage of these methods is, that they are either time-consuming and labour-intensive (sanger sequencing) or costly (Next Generation Sequencing). For this reason, these methods are not ideal for clinical routine diagnostics, where a large number of samples has to be analyzed every day. Besides sequence-based methods MALDI-TOF-mass spectrometry has become a standard method for genus and species identification. This method is based on the detection of low-molecular, primarily ribosomal proteins. Allelic isoforms of these proteins (biomarker proteins) differing in mass are the cornerstone of a new typing procedure referred to as proteotyping. Basis of this procedure is an amino acid sequence list of allelic isoforms that occur due to non-synonymous mutations in genes coding for biomarker proteins and appear as mass shifts when overlay- ing calibrated MALDI-TOF spectra. Based on the detectable biomarker masses and mass shifts it is possible to de- duce an isolate-specific combination of amino acids. Using hierarchical clustering algorithms, it is possible to calculate phyloproteomic dendrograms analogous to sequence-based methods. Proteotyping offers a great potential for subspecies differentiation, which will be demonstrated by means of the bacteria Campylobacter coli, Campylobacter fetus and Clostridioides difficile