Uso del nitrógeno en algas: desvelando piezas del rompecabezas de la asimilación del nitrógeno y su regulación en el alga modelo Chlamydomonas reinhardtii

Las algas, formando parte de la base de la cadena trófica de ecosistemas marinos y de agua dulce, son clave para la vida acuática. Estos organismos fotosintéticos, sometidos a fluctuaciones constantes de disponibilidad de nutrientes, muestran un alto nivel de adaptabilidad a estos ambientes dinámicos. Aunque el nitrógeno (N), nutriente esencial para la vida, es comúnmente usado por las algas en su forma inorgánica, algunas especies de algas pueden usar compuestos de N orgánico, los cuales pueden ser especialmente abundantes debido a la escorrentía y filtrado de áreas fertilizadas de forma intensiva. El alga modelo Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) puede consumir fuentes de nitrógeno inorgánico (amonio, nitrato y nitrito), así como L-arginina y urea. Además, este alga presenta una Laminoácido oxidasa extracelular (LAO1) que desamina un amplio rango de aminoácidos. En este trabajo hemos estudiado el control de la señalización que da lugar a la preferencia de nitrato sobre N orgánico en Chlamydomonas, el papel clave de LAO1 en el uso de aminoácidos y péptidos, así como el establecimiento de nuevas interacciones mutualistas con bacterias que promueven el crecimiento en N orgánico. Capítulo 1 El factor de transcripción NIT2 es el regulador clave de los genes de la asimilación de nitrato en Chlamydomonas. En primer lugar, comparamos el transcriptoma de una estirpe silvestre y otra mutante nit2 de Chlamydomonas en respuesta a nitrato. Observamos que nitrato y NIT2 reprimen los genes involucrados en el uso de fuentes de N orgánicas, incluyendo LAO1. Mediante el uso de mutantes de Chlamydomonas demostramos que tanto el nitrato como el nitrito afectan negativamente el uso de aminoácidos por este alga. Capítulo 2 Las enzimas L-aminoácido oxidasa (LAAO, L-Amino Acid Oxidase) están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se propone que su papel principal en hongos y algas es la captación de nitrógeno. Mediante búsquedas genómicas comparativas, no pudimos encontrar ningún ortólogo de LAO1 en ningún alga verde ni en plantas, pero identificamos ortólogos en 10 de otras 27 especies de algas, incluyendo Rhodophyta, Alveolata, Heterokonta, Haptophyta y Dinophyta. La construcción de un árbol filogenético de enzimas LAAO reveló que las secuencias identificadas como ortólogas de LAO1 -denominadas aquí como ALAAOs (Algal LAAOs)-, se agrupaban en la misma rama evolutiva. Observamos que en Chlamydomonas el gen LAO1 está situado adyacente a un gen que codifica una putativa proteína RidA, que resultó estar evolutivamente cercana a la de cianobacterias. Nuestro análisis filogenético apoya la idea de que las proteínas ALAAOs pueden tener un origen en el ancestro común de las algas, el cual se originó por la endosimbiosis de una cianobacteria por un protista. Mediante el uso de un mutante lao1 hemos mostrado que LAO1 era crucial para el crecimiento de Chlamydomonas en 16 de 20 aminoácidos proteinogénicos, así como para algunos di-/tri-péptidos. Además de amonio, las enzimas LAAO producen el correspondiente cetoácido y peróxido de hidrógeno. Hemos demostrado que la reacción espontánea de los productos derivados de la desaminación por LAO1 de Lalanina -ácido pirúvico y peróxido de hidrógeno- genera ácido acético. Capítulo 3 Aunque Chlamydomonas puede crecer en la mayoría de los L-aminoácidos y en algunos di-/tri-péptidos como únicas fuentes de N, este crecimiento es mucho menos eficiente que en fuentes de N inorgánicas, y además, algunos aminoácidos y péptidos no pueden ser usados por este alga. De forma fortuita descubrimos una contaminación Methylobacterium sp. que permitió el crecimiento de Chlamydomonas en un di-péptido que no puede asimilar. Las especies de Methylobacterium están incluidas en el grupo de bacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPB, del inglés Plant Growth- Promoting Bacteria), las cuales mejoran el crecimiento de las plantas. Tras el muestreo en campo, aislamiento e identificación de bacterias, encontramos que algunas especies salvajes, incluidas en los géneros Methylobacterium, Sphingomonas, Deinococcus y Chitinophagaceae, mejoran el crecimiento de Chlamydomonas en L-serina. Además, algunas especies de Methylobacterium permitieron el crecimiento de Chlamydomonas en algunos aminoácidos y péptidos que este alga no puede usar. Hemos demostrado un nuevo mutualismo basado en un intercambio metabólico de carbono y nitrógeno entre Chlamydomonas y M. aquaticum. Por otro lado, algunas especies de Methylobacterium mejoraron el crecimiento de Chlamydomonas en aminoácidos asimilables. Para esta mejora, la enzima LAO1 fue esencial para el crecimiento del consorcio con algunas estirpes de Methylobacterium, incluyendo M. extorquens, M. hispanicum y M. organophilum. La comunicación química en la interacción entre organismos diferentes media las relaciones simbióticas. Entre estas moléculas de señalización, el ácido indolacético es una de las más estudiadas. Descubrimos que la producción de índoles dependiente de L-triptófano por Chlamydomonas, observada aquí por primera vez, disminuyó significativamente en el mutante lao1. Además, observamos que altas concentraciones de ácido indolacético (> 30 μM) inhibe el crecimiento de Chlamydomonas y que esta inhibición se puede reducir por la presencia de especies de Methylobacterium.Algae, lying on the basis of food webs in marine and freshwater ecosystems, are key for aquatic life. These photosynthetic organisms live under continuously fluctuating nutrients availability, showing a high level of adaptability to these dynamic environments. Although the essential nutrient Nitrogen (N) is usually used by algae in its inorganic form, some algal species can use organic N compounds, which may become especially abundant due to terrestrial leaking and runoff of highly fertilized areas. The model alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) uptakes inorganic N sources (i.e. ammonium, nitrate and nitrite), as well as L-arginine and urea. Moreover, this alga presents an extracellular L-amino acid oxidase (LAO1) with a broad substrate specificity that scavenges N from L-amino acids. In this work we studied the signaling control that leads the preference for nitrate over organic N in Chlamydomonas, the key role of LAO1 in the use of amino acids and peptides, as well as the establishment of new mutualistic interactions with bacteria to facilitate growth on organic N. Chapter 1 The transcription factor NIT2 is the key regulator of nitrate assimilation genes in Chlamydomonas. First, we compared the transcriptome of Chlamydomonas wild type (WT) and a nit2 mutant in response to nitrate. We observed that nitrate and NIT2 down-regulated genes involved in organic N scavenging, including LAO1. By the use of Chlamydomonas mutant strains we demonstrated that both nitrate and nitrite negatively impact the use of amino acids by this alga. Chapter 2 L-amino acid oxidase (LAAO) enzymes are widely present in nature and a major role as N scavenger has been proposed in fungal and algal LAAOs. By comparative genomic searches, we could not find any LAO1 ortholog in any green plant or plant, but we identified orthologs in 10 out of 27 other algal species, including Rhodophyta, Alveolata, Heterokonta, Haptophyta and Dinophyta algae. The construction of a LAAO phylogenetic tree revealed that algal protein sequences identified as LAO1 orthologs -named here as ALAAOs (Algal LAAOs)-, clustered on the same evolutionary branch. We observed that Chlamydomonas LAO1 gene is clustered to a putative RidA gene (LAO2), which resulted to be closely related to cyanobacterial members. Our phylogenetic analysis favoured the idea that ALAAOs may have a common origin in the archaeplastidan ancestor, originated by a protist engulfing cyanobacteria. By the use of a lao1 mutant, we showed that LAO1 was crucial for Chlamydomonas growth on 16 out of 20 proteinogenic amino acids, as well as for some di- and tripeptides. Besides ammonium, LAAO produces keto acids and hydrogen peroxide. We have demonstrated that the spontaneous reaction of the LAO1-derived products generated by L-alanine deamination, pyruvic acid and hydrogen peroxide, generates acetic acid. Chapter 3 Although Chlamydomonas can grow on most amino acids and some di-/tripeptides as the sole N sources, this growth is far less efficient than that on inorganic N, and yet, there are some amino acids and peptides that cannot be used by this alga. We serendipitously found a contaminating Methylobacterium sp. that allowed Chlamydomonas growth on a dipeptide that is not readily assimilated by this alga. Methylobacterium spp. are included in the PGPB group of bacteria (Plant Growth-Promoting Bacteria), which improve plant growth and fitness. After field sampling, isolation and identification of some bacteria, we found that some wild species, included in Methylobacterium, Sphingomonas, Deinococcus, and Chitinophagaceae genera, promoted Chlamydomonas growth on L-serine. Moreover, some Methylobacterium spp. allowed Chlamydomonas growth on amino acids and peptides that are not used by this alga. We have demonstrated a new mutualism based on carbon-nitrogen metabolic exchange between Chlamydomonas and M. aquaticum. Otherwise, some Methylobacterium spp. improved Chlamydomonas growth on assimilable amino acids. For this growth promotion, LAO1 was crucial for consortia growth with some Methylobacterium spp., including M. extorquens, M. hispanicum and M. organophilum. The chemical cross-talk between interacting organisms mediates the beneficial and pathogenic symbiotic relationships. Within these inter-kingdom signal molecules IAA (Indole-3-Acetic Acid) is one of the best studied. We found that L-tryptophan-dependent indoles production in Chlamydomonas, observed here for the first time, was significantly reduced in the lao1 mutant. Moreover, we observed that high levels of exogenously added IAA (> 30 μM) inhibits Chlamydomonas growth and that this inhibition may be relieved by the presence of Methylobacterium spp