Application of a soft composite scaffold for the regeneration of segmental bone defects in a novel animal model – radiological and histological evaluation in sheep

Die Heilung großer segmentaler Knochendefekte bedingt durch degenerative, entzündliche oder traumatische Erkrankungen stellt noch immer ein besonderes klinisches und sozioökonomisches Problem dar. Aktuelle Therapieverfahren zur Rekonstruktion ausgedehnter segmentaler Knochendefekte umfassen die Knochendistraktion und den vaskularisierten, autologen oder allogenen Knochentransfer, aber auch Scaffolds in Form von Cages finden in großen Defekten Verwendung. Durch die mit diesen Verfahren verbundenen Komplikationen, wie Pininfektionen bei der Ilizarov-Technik oder eine erhöhte Entnahmemorbidität, Infektionsgefahr, schlechte Einheilungsraten und die oft nicht ausreichende Menge an gewonnenem Knochen beim Knochentransfer, wird seit langem an einer Alternative für den autologen Knochenersatz geforscht. In dieser Studie wurde deshalb untersucht ob sich ein mittels Hybrid-Ringfixateur stabilisierter 40-mm-Osteotomiedefekt in der Schafstibia eignet regenerative Therapieansätze zu untersuchen. Weiterhin sollte als ein Therapieansatz ein Poly-l-(lactid)-ε-Caprolacton/β-Trikalziumphosphat-Scaffold in den 40 mm Tibiadefekt eingebracht und auf seine Eignung, die Regeneration in einem kritischen segmentalen Knochendefekt zu unterstützen, untersucht werden. Zusätzlich wurde in einer Gruppe der PCL/β-TCP-Scaffold mit autologer Spongiosa gefüllt, um deren Wirkung in Kombination mit dem Knochenersatzmaterial PCL/β-TCP auf die Knochendefektheilung zu untersuchen. Dazu wurden zwölf Merino-Mix-Schafe in zwei Gruppen zu je sechs Tieren eingeteilt. Es wurde eine Osteotomie in der rechten Tibia vorgenommen und ein 40-mm-Defekt geschaffen, der durch einen Hybrid-Ringfixateur stabilisiert wurde. In den 40-mm-Osteotomie-Defekt wurde in der ersten Gruppe der hohlzylindrische Scaffold allein und in der zweiten Gruppe der mit Spongiosa gefüllte Scaffold eingebracht. Zwölf Wochen postoperativ erfolgte die Entnahme der Proben und die röntgenologische, computertomographische, histomorphologische, histomorphometrische und immunhistochemische Auswertung der Heilung im kritischen Defekt. Der verwendete Hybrid-Ringfixateur erwies sich als adäquates Stabilisierungssystem für einen 40-mm-Osteotomiedefekt in der Schafstibia. Das Modell erwies sich als geeignet zur Untersuchung regenerativer Therapieansätze. Die Verwendung des Kompositscaffolds aus PCL-β-TCP unterstützt die Regeneration eines segmentalen, kritischen Knochendefektes. Der Scaffold blieb in seiner Form stabil, diente als Platzhalter im Defekt, verhinderte einen Prolaps von Weich- oder Muskelgewebe in den Defekt und diente als Leitstruktur indem er durch seine Mikrostruktur das Einwandern von Zellen und das Einwachsen von lockerem Bindegewebe, Gefäßen und auch Knochengewebe ermöglichte. Durch die Kombination des Scaffolds (ChronOS Strip®) mit autologer Spongiosa in der zweiten Gruppe wurde die Knochenneubildung initial beschleunigt und bei einzelnen Tieren auch gesteigert. Die zweite Gruppe (ChronOS Strip® + Spongiosa) zeigte im Vergleich zur ersten nach zwölf Wochen ein vorangeschrittenes Heilungsergebnis. Röntgenologisch zeigten zwei Tiere dieser Gruppe bereits nach acht Wochen eine Überbrückung des 40 mm Osteotomiedefektes und nach zwölf Wochen eine weitere Zunahme der Dichte des neugebildeten Kallus. Histomorphometrisch machte in beiden Gruppen nach 12 Wochen Bindegewebe den hauptsächlichen Gewebeanteil im Osteotomiespalt aus. Hinsichtlich des knöchernen Kallus war computertomographisch (Bone Volume) und histomorphometrisch (Bone Area) keine signifikante Steigerung der Knochenneubildung durch autologe Spongiosa im Vergleich zur ersten Gruppe erkennbar. Allerdings erreichten in der zweiten Gruppe einige Tiere höhere Werte. Die Knochenmineraldichte (BMD) und der Knochenmineralgehalt (BMC) zeigten in den beiden Gruppen im Median ähnliche Werte. Lediglich bei zwei Tieren der zweiten Gruppe mit unilateraler Überbrückung des Osteotomiedefektes war bereits Lamellenknochen zu beobachten. Histomorphologisch war darüberhinaus kein qualitativer Unterschied des gebildeten Kallusgewebes zwischen den Gruppen erkennbar; allein die Kortikalis erschien in der zweiten Gruppe stärker aufgelockert. Auch die Vaskularisierung und Osteoklastendichte war in beiden Gruppen der vorliegenden Studie vergleichbar. Die Verzögerung der Defektheilung ist daher nicht auf eine unzureichende Vaskularisierung oder einen übermäßigen Knochenabbau durch Osteoklasten zurückzuführen. Ebenso war in beiden Gruppen die beginnende Degradation des Scaffolds durch Riesenzellen in vergleichbarem Ausmaß zu beobachten. Die Zugabe autologer Spongiosa (Gruppe 2) führte bei einzelnen Tieren zu einer deutlichen Steigerung der Knochenneubildung, der Vaskularisierung sowie der Osteoklasten und Riesenzelldichte, im Vergleich zwischen den Gruppen wurde jedoch kein statistisch signifikanter Unterschied erreicht. Der verwendete Scaffold erwies sich in beiden Gruppen als Leitstruktur, die das Einsprossen von Gefäßen und die Migration von Osteoklasten und Riesenzellen in den Defekt ermöglichte.The healing of large segmental bone defects caused by degenerative, inflammatory or traumatic diseases pose a major clinical and socioeconomic problem. Current treatment methods for the reconstruction of large segmental bone defects include bone distraction, vascularised, autologous or allogenic bone grafting and even cages that are used as scaffolds. Because of procedure associated complications, such as pin infections in the Ilizarov-technique or an increased donor site morbidity, the risk of infection, poor healing rates and the frequently insufficient amount of recovered bone, there has been a longstanding history of research in this field. The aim of this study was to examine a 40 mm osteotomy defect model, stabilised by a hybrid ring fixator, in the tibia of the sheep and its qualification to enable the investigations of regenerative therapies. In particular, as such a therapeutic approach, a poly-l-(lactid)-ε-caprolacton/β-tricalciumphosphat-scaffold was put into the 40 mm tibial defect and tested if it is qualified to support the regeneration in a critical segmental bone defect. Additionally, in one group the PCL/β-TCP- scaffold was filled with autologous bone graft to investigate its effect in combination with the bone substitute on the bone defect healing. Twelve merino-mix-sheep were randomly assigned in two groups. A 40 mm osteotomy defect in the right tibia was set and stabilised by a hybrid ring fixator. In the first group the osteotomy defect was filled with the scaffold alone, which was formed into hollow cylindrical shape. In the second group the hollow cylindrical shaped scaffold was filled with autologous cancellous bone from the iliaci crest. Twelve weeks after surgical treatment, the defect zone was removed for radiological, histomorphological, histomorphometrical and immunhistochemical examination of the defect healing. The hybrid ring fixator used in this study proved to be an adequate stabilization system for the study of regenerative therapies in a 40 mm osteotomy defect model. And also the use of the composit scaffold (PCL-β-TCP) proved to be appropriate to support the regeneration in a segmental critical size defect. It remained stable in its form, served as a placeholder in the defect, prevented a prolapse of soft or muscle tissue into the defect and allowed by its microstructure and migration of cells and ingrowth of loose connective tissue and blood vessels. By combining the scaffold (chronOS strip®) and autologous cancellous bone the bone formation was initially accelerated and also increased, but not statistically significant. After twelve weeks the second group (chronOS strip® + ABG) showed an advanced healing result. After eight weeks the radiographs showed two animals of this group with a bridging of the 40 mm osteotomy defect and an increased callus formation after twelve weeks. According to the histomorphometrical investigations after 12 weeks in both groups, the main part was formed of connective tissue. Conforming to the new bone formation neither the computertomographic nor the histomorphometric measurements showed a significant increase of new bone formation by autologous bone graft compared to the first group. Certainly, in the second group some animals showed increased results. The bone mineral density and the bone mineral content in both groups showed similar median values. Two animals in the second group showed a unilateral bony bridging of the defect on the lateral side with partially already remodeled bone tissue organized to lamellar bone. Histologically, there was no further qualitative difference in the new formed bone, only the cortical bone in the second group appeared loosened. The vascularization and the osteoclast density were similar in both groups. Hence, the delay of the defect healing is not due to the insufficient vascularization or excessive bone resorption by osteoclasts. In both groups the onset of degradation of the scaffold by giant cells could be observed in a similar fashion. The addition of autologous bone graft (group 2) resulted for some animals in a distinct increase of new bone formation, vascularization, osteoclast and giant cell density. However, no statistically significant difference was achieved compared between the groups. Nonetheless, the used scaffold served in both groups as a guiding structure that enabled the ingrowth of loose connective tissue, vessels, osteoclasts and giant cells into the defect