Molecular and cellular characterization of rAAV-mediated gene targeting

Vektoren des Adeno-Assoziierten Virus (AAV) zeichnen sich durch eine Reihe von vorteilhaften Eigenschaften aus, wie beispielsweise einer geringen Immunanwort, ein breites Wirtszellspektrum sowie die Fähigkeit sowohl ruhende als auch sich teilende Zellen infizieren zu können. Aufgrund dieser Eigenschaften sind rekombinante AAV-Vektoren (rAAV) geradezu als Gentherapievektoren prädestiniert. Ziel meiner Arbeit war die Etablierung eines rAAV-vermittelten Gentargeting-Systems, das als proof of principle System verwendet wurde, um ein defektes egfp-Gen über Homologe Rekombination (HR) direkt am mutierten Ziellokus korrigieren zu können. Dafür wurden verschiedene menschliche Zelllinien mit einem integriert vorliegenden mutierten egfp-Gen mit rAAV-Vektoren kotransduziert. Für das Gentargeting wurde die zum mutierten Ziellokus homologe Donor-DNA sowie die I-SceI- Endonuklease als auch die spezifisch für den Ziellokus konstruierten Zinkfingernukleasen (ZFNs), für das Einführen eines DNA-Doppelstrangbruches (DSB) am mutierten Ziellokus, in rAAV-Vektoren verpackt. Die Genkorrekturfrequenz wurde durch die Messung der EGFP-positiven Zellen im Durchflusszytometer bestimmt. Dabei konnte durch das Einführen eines I-SceI- induzierten DSB in den mutierten Ziellokus das Gentargeting um ein 6500faches stimuliert werden. Durch die Verwendung eines einzelnen rAAV-Vektors, der sowohl für die Donorsequenz als auch für die I-SceI-Endonuklease kodierte, konnten Gentargetingfrequenzen bis zu 65% erreicht werden. Im Gegensatz dazu führten Infektion mit zwei rAAV-Vektoren, rAAV-SceI und rAAV-Donor, zu 25% EGFP-positiven Zellen. Unter Verwendung von rAAV-ZFNs wurden Gentargetingfrequenzen bis 10% erreicht. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Gentargetingfrequenz vom Zelltyp, der rAAV-Vektordosis und der Donorvektor- Architektur abhängig war. Obwohl jedes Integrationsereignis auch immer mit der Gefahr einer Mutagenese der transduzierten Zelle verbunden sein kann, konnten rAAV-Vektoren bisher nicht mit einer onkogenen Transformation in Verbindung gebracht werden. Nichts desto trotz wurde, im Hinblick auf zukünftige klinische Versuche, das Risikopotenzial des rAAV-vermittelten Gentargetings durch Bestimmung der Targeting Ratio als ein Chancen/Risiko-Faktor untersucht. Mit Hilfe der durchflusszytometrischen Daten konnte ein Verhältnis von 1 Genkorrekturereignis zu 230 rAAV-Zufallsintegrationen bestimmt werden, dass durch Einführen eines spezifischen DSB im mutierten Ziellokus auf 1:5 verbessert werden konnte. Diese Ergebnisse konnten mit Hilfe von Allel- spezifischen real-time PCRs auf genomischer Ebene bestätigt werden. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass mit Hilfe von speziell konstruierten rAAV- Vektoren therapeutisch relevante Gentargetingfrequenzen erzielt werden konnten. Das rAAV-vermittelte Gentargeting ist daher ein vielversprechender therapeutischer Ansatz, um bestimmte Erbkrankheiten in naher Zukunft behandeln zu können.Vectors based on adeno-associated virus (AAV) have a number of advantageous properties, such as low immunogenicity, a broad host range and the ability to transduce dividing and non-dividing cells. Due to these abilities recombinant AAV vectors hold great promise as gene therapy vectors. In my thesis I aimed at establishing an AAV-mediated gene targeting system. In a proof-of-principle approach a mutated egfp gene was corrected by homologous recombination (HR) directly at the mutated target locus. To this end, different human target cell lines with an integrated mutated egfp target locus were co-transduced with AAV vectors, which either served as a donor vector for gene targeting or that contained expression cassettes encoding the I-SceI homing endonuclease or specifically designed zinc-finger nucleases (ZFNs) for introducing a DNA double strand break (DSB) at the target locus. The frequency of gene correction was detected by assessing the number of EGFP-positive cells using flow cytometry. As shown, gene targeting at the mutated egfp target locus could be stimulated up to 6500-fold by an I-SceI-induced DSB. Using a single AAV-vector, encoding the I-SceI endonuclease and the donor sequence, gene targeting frequencies up to 65% were reached. In contrast, infections with two vectors, AAV-SceI and AAV-donor, rendered up to 25% of EGFP-positive cells. Moreover, when using AAV-ZFNs gene conversion was observed in up to 10% of the target cells. My data further revealed that the gene targeting frequency was dependent on the cell type, the vector dose and the donor vector architecture. Even though integration events can potentially lead to mutagenesis of transduced cells, AAV-based vectors have never been associated with oncogenic transformation. Nonetheless, with regard to future clinical trials, I assessed the potential risk of AAV-mediated gene targeting by determining the targeting ratio as a risk/benefit indicator. A targeting ratio of 1 gene correction event per 230 random AAV integration events were calculated based on the flow cytometry data. This ratio could be improved to 1:13 upon insertion of a specific DSB in the egfp target locus. The phenotypic targeting ratio could be confirmed on the genomic level using allele-specific real-time PCR. In summary, transduction of target cells with appropriately designed AAV vectors can induce therapeutically relevant gene targeting frequencies. AAV-mediated gene targeting could hence be a promising therapeutic approach to treat certain inherited disorders in the near future