Strukturbestimmung des aktiven Zentrums im integralen Membranprotein Bakteriorhodopsin und Entwicklung von Methoden zur Berechnung des Effekts von gepulsten Feldgradienten auf hochaufgeloeste NMR Spektren

CONTENT 1 INTRODUCTION 3 1.1 Topics of this thesis 4 1.2 Nuclear magnetic resonance 6 1.3 NMR structure determination of proteins in solution 10 1.1 Bacteriorhodopsin 14 1.1 References 16 2 PULSED FIELD GRADIENTS IN HIGH RESOLUTION NMR 19 2.1 Pulsed field gradients in NMR 20 2.2 Theory 21 2.3 Pathway selection and artifact suppression 29 2.4 Diffusion in multi-pulse heteronuclear experiments 53 2.5 Discussion 63 2.6 References 66 3 NMR INVESTIGATIONS OF BACTERIORHODOPSIN 71 3.1 NMR strategies for structural investigation of membrane proteins 72 3.2 Labelling and assignment strategy used in this thesis 76 3.3 Practical aspects of NMR measurements and data processing 77 3.4 Proton assignments of bacteriorhodopsin 80 3.5 Analysis of the chemical shifts 89 3.6 Derivation of distance constraints 101 3.7 Bacteriorhodopsin structures 114 3.8 Discussion 133 3.9 References 138 APPENDIX A 1H and 13C assignments for dodecyl-maltoside 143 B Concentration dependence of detergent chemical shifts and diffusion coefficients 149 C Size of the detergent and protein/detergent micelles 155 D Estimated proton relaxation times 161The development and application of high-resolution NMR methods for protein structure determination was the topic of the present thesis. Methods for calculating sequences of pulsed field gradients for signal selection as well as the influence of diffusion on the signal amplitudes were discussed in the first part, while the second part dealt with the structure determination of the retinal environment of the integral membrane protein bacteriorhodopsin based on a novel labelling strategy. Pulsed field gradients are an important tool for signal selection and artifact suppression in modern high-resolution NMR. As part of the present work, the computer programs TRIPLE GRADIENT and Z GRADIENT for the calculation of optimized sequences of pulsed field gradients for arbitrary experiments were developed and tested. Signal selection under consideration of rf-pulse imperfections was exemplified for the HSQC experiment. The formalism on which the programs are based was extended to include stochastic as well as deterministic translational motion of the molecules. As a quantitative example, the influence of diffusion on the HQQC experiment was discussed. It was shown that the diffusion coefficient of ethanol can be reproduced correctly from an analysis of the line-widths in the indirect dimension. The integral membrane protein bacteriorhodopsin was solubilized in dodecyl- maltoside micelles. Completely deuterated samples with selectively protonated moieties of the protein detergent complex with a molecular weight of more than 60 kDa were used to record 1H NOESY spectra and to obtain sequence specific resonance assignments. Structures of both forms of the dark-adapted protein were determined from distances between protons in the retinal binding pocket. The theoretical analysis of the chemical shifts as well as a comparison of the all-trans/15-anti NMR structure to crystal structures shows the high accuracy of this method to obtain NMR structures. The high resolution structure of the 13-cis/15-syn form, now obtained for the first time, was able to reveal a shorter distance between the protonated Schiff-base and its complex counterion than found in the all-trans/15-anti form. The relative position of the retinal carbon atoms to the neighboring tryptophan side-chains is almost identical to that of an early intermediate of the photocycle, in which the retinal is in 13-cis/15-anti conformation.Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Anwendung und Weiterentwicklung von hochauflösenden NMR Methoden zur Proteinstrukturbestimmung. Im ersten Teil wurden Methoden zur Berechnung von Sequenzen gepulster Feldgradienten für die Signalselektion, sowie der Einfluß der Diffusion auf die Signalamplituden diskutiert, im zweiten die Strukturbestimmung der Retinalumgebung des integralen Membranproteins Baketeriorhodopsin auf der Basis einer neuen Markierungsstrategie. Gepulste Feldgradienten sind als Mittel zur Signalselektion und Artefaktunterdrückung aus der modernen hochauflösenden NMR Spektroskopie nicht mehr wegzudenken. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Computerprogramme TRIPLE GRADIENT und Z GRADIENT zur Berechnung von optimierten Sequenzen gepulster Feldgradienten für beliebige Experimente entwickelt und erprobt. Signalselektion auch unter Berücksichtigung imperfekter RF-Pulse wurde exemplarisch am HSQC Experiment gezeigt. Der den Programmen zugrunde liegende theoretische Formalismus wurde erweitert, um erstmals sowohl stochastische als auch deterministische translatorische Bewegungen der Teilchen zu berücksichtigen. Als quantitatives Beispiel wurde der Einfluss freier Diffusion der Moleküle im HQQC Experiment diskutiert. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, daß die Diffusionkonstante von Ethanol korrekt aus der Analyse der Linienbreiten in der indirekten Dimension bestimmt werden kann. Das integrale Membranprotein Bakteriorhodopsin wurde in Dodecylmaltosid Mizellen solubilisiert. An vollständig deuterierten Proben mit einzelnen protonierten Resten des Protein-Detergenz-Komplex mit einem Molekülgewicht von mehr als 60 kDa wurden 1H NOESY Spektren aufgenommen und sequenzspezifische Signalzuordnungen erzielt. Strukturen beider Formen des Proteins im dunkel- adaptierten Grundzustand wurden mit Hilfe von Abständen zwischen Protonen in der Retinalbindungstasche bestimmt. Die theoretische Analyse der chemischen Verschiebungen und der Vergleich der all-trans/15-anti NMR Struktur mit Kristallstrukturen belegte die hohe Genauigkeit dieser Methode der NMR Strukturbestimmung. In der erstmals bestimmten 13-cis/15-syn Struktur ist der Abstand zwischen protonierter Schiff'scher Base und ihrem komplexen Gegenion kürzer im Vergleich zur all-trans/15-anti Struktur. Die relative Position der Retinalkohlenstoffe zu benachbarten Tryptophanseitenketten ist fast identisch mit der Kristallstruktur eines frühen Intermediaten des Photozyklus, bei der das Retinal in 13-cis/15-anti Konfiguration vorliegt