\- structure, function and development of non-peptidic analogs

1\. Titelblatt und Inhalt 2\. Einleitung 1 3\. Material und Methoden 27 4\. Ergebnisse 48 5\. Diskussion und Zusammenfassung 91 6\. Literatur 112Arginin- und tryptophanreiche Motive sind in vielen natürlichen antimikrobiellen Peptiden vorhanden. Auch kombinatorischen Peptidbibliotheken entnommene antimikrobielle Peptide weisen arginin- und tryptophanreiche Motive auf. Das Hexapeptid cyclo(RRWWRF) ist eine der kürzesten antimikrobiell wirksamen Sequenzen. In dieser Arbeit wurden die Konfor-mationen des Peptides in Lösung und gebunden an Mizellen bestimmt, seine Wechselwirkung mit Lipiden untersucht und basierend auf diesen Erkenntnissen nicht-peptidische Analoga entwickelt. Es zeigte sich, dass das Peptid cyclo(RRWWRF) in Lösung weniger gut strukturiert ist, während es gebunden an SDS- und DPC-Mizellen eine gut definierte amphipathische Struktur einnimmt. Durch die Bestimmung der T1-Zeiten in Gegenwart einer paramagnetischen Verbindung sowie durch NOEs zwischen Peptidprotonen und Protonen der SDS- und DPC-Mizellen wurde festgestellt, dass das Peptid an der Mizell-Wasser-Grenzfläche lokalisiert und der hydrophile Teil des Moleküls dem Wasser zugewandt war. Strukturuntersuchungen an substituierten Peptiden erlaubten Einblicke in den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der Peptide. Entscheidend für die Aktivität waren die Guanidinogruppen der Argininseitenketten sowie das Vorhandensein voluminöser hydrophober Gruppen, wie die Seitenketten der Tryptophane. Um die in mizellarer Umgebung gewonnenen Strukturinfor-mationen auf Lipiddoppelschichten übertragen zu können, wurden Moleküldynamiksimulationen von Membransystemen aus cyclo(RRWWRF)-Peptiden und Dipalmitoylphosphatidylcholin-Molekülen in unterschiedlichen Zusammen- setzungen durchgeführt. Diese Simulationen bestätigten die NMR-Strukturdaten hinsichtlich der Konformation und der Lokalisation des Peptides. Die Lipide waren an der Grenzschicht komprimiert und es wurde eine Störung der elektrostatischen Wechselwirkungen der Lipide bewirkt. Die Argininseitenketten erwiesen sich als hervorragende Partner für Wasserstoffbrückenbindungen mit den Lipidkopfgruppen. Die resultierenden Peptid-Lipid-Komplexe reduzierten die Fluidität der Membran. Mit dem Peptid assoziiertes Wasser drang tief in den hydrophoben Bereich der Membran ein. Als Voraussetzungen für die antimikrobielle Aktivität wurden die folgenden Eigenschaften postuliert: 1. das Vorhandensein von drei Guanidinofunktionen, 2. das Vorhandensein von drei voluminösen Aromaten, 3. die Möglichkeit, eine amphipathische Struktur auszubilden. Diese Annahmen wurden durch das Design und die Synthese analoger nicht-peptidischer Verbindungen überprüft, bei denen drei Guanidine und drei Indole an ein Trimesinsäure-Grundgerüst gekoppelt wurden. Diese Verbindungen zeigten eine dem cyclo(RRWWRF)-Peptid ähnliche antimikrobielle Aktivität, die teilweise selektiv für Bacillus subtilis war. Diese neuen Analoga bestätigen zum einen die Gültigkeit der postulierten Aktivitätskriterien, sie stellen aber auch die ersten nicht-peptidischen Analoga tryptophan- und argininreicher Peptide dar.Arginine- and tryptophan-rich motifs are present in many natural antimicrobial peptides. Also antimicrobial peptides derived from combinatorial libraries displayed arginine- and tryptophan-rich motifs. The hexapeptide cyclo(RRWWRF) is one of the shortest sequences with antimicrobial activity. In this thesis, the structure of the peptide was determined in solution and bound to micelles. Furthermore, important peptide-lipid interactions were characterized and based on these results, non-peptidic analogues were developed. It was found that the peptide cyclo(RRWWRF) is less structured in solution, whereas when bound to SDS- and DPC-micelles, it adopts a well defined amphipathic structure. The determination of T1 times in presence of a paramagnetic compound and NOEs between protons of the peptide and the SDS- and DPC-micelles revealed the localisation of the peptide at the micelle-water interface and the orientation of the hydrophilic part of the molecule towards the water. The structure determination of substituted peptides allowed conclusions concerning the relationship between structure and function. The guanidine moieties of the arginine side chains as well as the existence of bulky hydrophobic groups like tryptophan side chains turned out to be crucial for the activity. In order to transfer the structural information derived from micellar environments to a lipid bilayer, molecular dynamics simulations were carried out consisting of DPPC membranes with different numbers of cyclo(RRWWRF) peptides. These simulations confirmed the NMR data concerning the conformation and the localisation of the peptide. The lipids were compressed at the interface and the electrostatic interactions of the lipids were perturbed. The arginine side chains appeared to be well suited to bind to lipid head groups through hydrogen bonds, the resulting complexes of peptides and lipids reduced the membrane fluidity. Peptide-associated water entered the hydrophobic regions of the membrane. As prerequisites for the antimicrobial activity, the following properties were postulated: 1. the presence of three guanidino moieties, 2. the presence of three bulky aromatic moieties, 3. the possibility to form an amphipathic structure. These assumptions were verified, through the design and the synthesis of analogous non-peptidic compounds, which had three guanidino moieties and three indoles coupled to a framework of trimesic acid. These compounds showed an antimicrobial activity similar to cyclo(RRWWRF), with some compounds being selective for Bacillus subtiltis. On one hand, these new analogues verified the postulated prerequisites for the activity. On the other hand, they represent the first non-peptidic analogues of tryptophan- and arginine-rich peptides