The insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) and histone deacetylases (HDAC) as promising targets for the treatment of gastrointestinal tumors

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis PublikationsverzeichnisDa die bisherigen Möglichkeiten zur Behandlung fortgeschrittener gastrointestinaler Tumore sehr unbefriedigend sind, ist die Entwicklung und Erforschung neuer innovativer Therapiemöglichkeiten dringend erforderlich. Der insulinähnliche Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF-1R) ist ein interessantes neues Zielprotein für neuartige und zielgerichtete Tumortherapien. In einer Vielzahl von Tumoren, u.a. gastrointestinale Tumore, ist der IGF-1R überexprimiert und/oder besitzt eine unphysiologisch hohe Aktivität, die eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung und Progression spielt. Histondeacetylasen (HDAC) gelten ebenfalls als sehr viel versprechende therapeutische Zielstrukturen für die molekulare Tumortherapie. Im Zusammenspiel mit den antagonistisch wirkenden Histonacetyltransferasen (HAT) kontrollieren sie das dynamische Gleichgewicht von Acetylierung und Deacetylierung von Histonen, welches eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression spielt. Bei einer Vielzahl von Tumoren ist eine dysregulierte HDAC- und HAT-Aktivität festzustellen. Derartige Störungen des zellspezifischen Acetylierungsmusters führen u.a. zu veränderter Genexpression und tragen so zu veränderten Proliferationsverhalten und der malignen Entartung der Zelle bei. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirksamkeit von therapeutisch interessanten Interventionen zu testen, bei denen die Aktivität des IGF-1-Rezeptors bzw. von Histondeacetylasen bei verschiedenen gastrointestinalen Tumoren inhibiert wird, da diese bislang noch nicht in diesem Zusammenhang untersucht worden ist. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die antiproliferative Wirksamkeit der IGF-1-Rezeptor-Inhibition an drei gastrointestinalen Tumorentitäten, den gastrointestinalen neuroendokrinen Tumoren (NET), dem hepatozellulären Karzinom (HCC) und dem kolorektalen Karzinom (CRC) untersucht werden. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Inhibition des IGF-1R durch den spezifischen IGF-1R-Tyrosinkinaseinhibitor NVP-AEW541 signifikant das Zellwachstum dieser drei Tumorentitäten zeit- und dosisabhängig hemmte. Die antiproliferative Wirkung der IGF-1R-Inhibition ließ sich auch an Primärzellkulturen humaner gastrointestinaler neuroendokriner Tumoren und kolorektalen Karzinomen bestätigen. Primärzellkulturen wurden zusätzlich untersucht, da sie im Vergleich zu Zelllinien ein patientennäheres Untersuchungsmodell darstellen. Außerdem stellen sie eine Möglichkeit der individualisierten Tumortherapie dar. Es konnte gezeigt werden, dass die antiproliferative Wirkung der IGF-1R-Inhibition sowohl auf der Induktion von mitochondrienvermittelter Apoptose als auch auf einem Zellzyklusarrest am G1/S-Kontrollpunkt beruhte. Mittels Western Blot Analysen wurden die zugrunde liegenden Expressionsveränderungen apoptose- und zellzyklusrelevanter Proteine dargestellt, die an der antiproliferativen Wirkung beteiligt waren. Das proapoptotische Protein Bax war hochreguliert, während das antiapoptotische Protein Bcl-2 supprimiert wurde. Außerdem waren die beiden Zellzyklusinhibitoren p21Waf1/Cip1 und p27Kip1 überexprimiert, während die Expression des Zellzykluspromoters Cyclin D1 inhibiert wurde. Weiterhin konnte durch die IGF-1R-Inhibition eine Unterbrechung bzw. Herunterregulierung des Ras-Raf-MAPK- und des PI3-K-Signalwegs demonstriert werden. Durch die Aufklärung der Wirkmechanismen von IGF-1R-Inhibitoren und der Charakterisierung der beteiligten Signaltransduktionswege konnten wichtige Erkenntnisse für kombinationstherapeutische Ansätze abgeleitet werden. In entsprechenden Kombinationsexperimenten konnte so auch gezeigt werden, dass durch simultane Applikation von IGF-1R-Inhibitoren und konventionellen Zytostatika eine (über-)additive Verstärkung der antiproliferativen Effekte erzielt werden kann. Auch eine kombinierte Blockade der miteinander interagierenden Wachstumsfaktorrezeptoren, IGF-1R und des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) wurde evaluiert. Es zeigte sich, dass die simultane Inhibition von IGF-1R und EGFR zu einer synergistischen Wirkungsverstärkung der antiproliferativen Effekte führte. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Wirksamkeit einer Inhibition von Histondeacetylasen (HDAC) auf das Wachstum gastrointestinaler neuroendokriner Tumore und cholangiozellulärer Karzinomzellen. Der Großteil der Anti-HDAC- Untersuchungen wurde mit dem neuen synthetischen Benzamid MS-275 durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Teil der Untersuchungen auch mit zwei natürlich vorkommenden Vertretern aus anderen Gruppen von HDAC-Inhibitoren, nämlich Trichostatin A und Natriumbutyrat, durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Inhibition der Histondeacetylasen durch die verschiedenen HDAC- Inhibitoren das Wachstum von neuroendokrinen und cholangiozellulären Karzinomzellen signifikant inhibiert, und dass daran Apoptose und Zellzyklusmodulationen beteiligt sind. Die HDAC-Inhibitor-induzierte Apoptose war durch eine erhöhte Aktivität der Caspase-3 und einer Fragmentierung der DNA charakterisiert. Die Modulationen des Zellzyklus durch HDAC-Inhibitoren führten in allen Zelllinien zu einem signifikanten G1/S-Arrest. Interessanterweise zeigte sich dabei, dass der Wirkungsmechanismus der Histondeacetylase-Inhibitoren zelltypspezifische Unterschiede aufwies, die in einem Teil der untersuchten Zelllinien neben dem Arrest in der G1/S-Phase des Zellzyklus zu einem zusätzlichen G2/M-Arrest führten. Auch auf der Proteinebene zeigten sich zelltypspezifische Unterschiede bei der Expression von apoptoserelevanten und zellzyklusregulierenden Proteinen. So wurde beispielsweise die Expression von antiapoptotischen Bcl-2 sowohl bei cholangiozellulären Karzinomen (CCC)-Zellen als auch bei neuroendokrinen Tumoren (NET)-Zellen supprimiert, während die Expression von proapoptotischen Bax nur bei CCC-Zellen hochreguliert wurde. Kombinationstherapeutische Ansätze von HDAC-Inhibitoren mit konventionellen Zytostatika und anderen neuen Antitumormedikamenten führten zu einer additiven Wirkungsverstärkung. Besonders wirkungsvoll waren dabei die Kombinationen des HDAC-Inhibitors MS-275 mit dem Multi-Kinase-Inhibitor Sorafenib oder mit dem Proteasominhibitor Bortezomib, die zu synergistischen Wachstumsinhibitionen führten. Die vorliegenden Untersuchungen belegen, dass die Inhibition des insulin-ähnlichen Wachstumsfaktorrezeptors 1 (IGF-1R) sowie die Inhibition von Histondeacetylasen (HDAC) neuartige und viel versprechende Ansätze zur zielgerichteten Therapie fortgeschrittener, gastrointestinaler Tumore darstellen. Die mögliche klinische Anwendung der hier vorgestellten Ansätze sollte aufgrund der sehr viel versprechenden in vitro-Ergebnisse künftig durch in vivo-Untersuchungen und klinische Studien evaluiert werden.Treatment options of advanced gastrointestial tumors are limited and unsatisfactory. Research and development of new innovative tumor therapies is therefore urgently needed. The insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) is a new and interesting target for innovative and targeted cancer therapy. In many human tumors including gastrointestinal tumors the IGF-1R is overexpressed and/or over-activated, which has been demonstrated to contribute to tumorigenesis and tumor progession. Histone deacetylases are recognized to be promising targets for molecular tumor therapy. The equilibrium of steady state acetylation of the histones is tightly controlled by antagonistic effects of histone acetyltransferases (HATs) and HDACs and is known to play an important role in the regulation of gene transcription. In a variety of tumors the activity of HDACs and HATs is dysregulated. Disruptions of the equilibrium of histone acetylation and deacetylation leads to an abberant expression of mitooncogenic genes thereby mediating tumor cell proliferation and tumorigenesis. This study was aimed to evaluate the potency of therapeutic interventions by an inhibition of the activity of the IGF-1R and the histone deacetylase activity respectively in several gastrointestinal tumors, as this has not yet been tested . In the first part of this work the antiproliferative effects of an IGF-1R inhibition in three gastrointestinal tumor entities, gastrointestinal neuroendocrine tumors (NET), hepatocellular carcinoma (HCC) and colorectal carcinoma (CRC), were investigated. In vitro studies in cell line models revealed that inhibition of IGF-1R by the specific IGF-1R tyrosine kinase inhibitor NVP-AEW541 significantly inhibited cell growth of all three gastrointestinal tumor models in a time- and dose-dependent manner. Antineoplastic effects of NVP-AEW541 were also detected in primary cultures of human NET and CRC, which were investigated in order to have a clinically more relevant cell model as compared to commercially available cell lines. In addition, they form the basis for an individualized tumor therapy. The antiproliferative effects of IGF-1R inhibition were found to be based on the induction of mitochondria-dependent apoptosis and an arrest of the cell cycle at the G1/S-checkpoint. Western blot analyses revealed respective changes of the expression pattern of apoptosis- and cell cycle- relevant proteins. In this respect the proapoptotic protein Bax was upregulated while antiapoptotic Bcl-2 was suppressed. Moreover, the two cell cycle inhibitors p21Waf1/Cip1 and p27Kip1 were overexpressed whereas the expression of the cell cycle promoter cyclin D1 was inhibited. Furthermore it could be demonstrated that IGF-1R inhibition causes downregulation of the Ras-Raf-MAPK- and the PI3-K signalling pathway. The in-depth characterization of the signalling events and pathways which were causative for the observed antineoplastic effects of the IGF-1R inhibition provided a rational for combination therapies. Combination treatment proved that coapplication of IGF-1R inhibitors with conventional cytostatics result in additive to even overadditive growth inhibition of gastrointestinal tumor cells. Since IGF-1R is known to interact with the epidermal growth factor receptor, the effect of targeting both the EGFR as well as IGF-1R by combination treatment was evaluated, too. In fact, the simultaneous inhibition of IGF-1R and EGFR enhanced the antiproliferative effect as compared to the effect of either agent alone. The second part of this work was to evaluate the effect of histone deacetylase (HDAC) inhibition on the growth of gastrointestinal neuroendocrine tumors (NET) and cholangiocarcinoma (CCC) cells. The anti-HDAC investigations were mainly performed with the synthetic benzamide MS-275. Additionally, a part of the investigations was also performed with two other, naturally occurring HDAC inhibitors, namely trichostatin A and sodium butyrate. All HDAC inhibitors exerted significant antiproliferative effects both in NET as well as in CCC cells by inducing apoptosis and interfering with cell cycle progression. HDAC inhibitor-induced apoptosis was characterized by activation of caspase-3 and subsequent DNA fragmentation. HDAC inhibition resulted in a significant cell cycle arrest at the G1-S checkpoint in all investigated cell lines. Interestingly, some of the investigated cell lines showed an additional G2/M arrest revealing cell type specific mode of action of HDAC inhibitors. Investigations of the expression pattern of apoptosis- and cell cycle-relevant proteins confirmed the cell type specific differences. For instance, expression of antiapoptotic Bcl-2 was dowregulated both in NET as well as in CCC cells, while proapoptotic Bax was solely upregulated in CCC cells. Combination treatment of HDAC inhibitors with conventional cytostatics or new, targeted anticancer agents respectively resulted in (over-)additive growth inhibitory effects. Especially combinations of the HDAC inhibitor MS-275 with the multi-kinase inhibitor sorafenib or the proteasome inhibitor bortezomib were highly effective both leading to synergistic growth inhibition. To conclude, the data of this work show that inhibition of the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) and also those of histone deacetylases (HDAC) represent two novel promising approaches for the treatment of advanced gastrointestinal tumors. In light of the encouraging in vitro-data, these innovative therapeutic concepts should be evaluated in vivo and in clinical studies in the future