Pharmacokinetic of linezolid in the biophase of healthy volunteers and critically ill patients

Titelblatt, Inhalts- u. Abkürzungsverzeichnis 2 1\. EINLEITUNG 2 1.1. Infektionen durch grampositive Bakterien 2 1.2. SIRS, Sepsis, septischer Schock 3 1.3 Linezolid 5 1.3.1 Physikochemische Eigenschaften 5 1.3.2 Pharmakokinetische Eigenschaften 5 1.3.3 Pharmakodynamische Eigenschaften 6 1.3.4 Klinische Anwendung 9 1.4 Konzentrationsmessung in der Biophase als Grundlage der Dosisindividualisierung 10 1.5 Verteilung von Arzneistoffen 13 1.5.1 Verteilungsmechanismen 13 1.5.2 Verteilung von Arzneistoffen bei Intensivpatienten 14 1.6 Zielsetzung 16 2\. MATERIAL, METHODEN UND KLINISCHE STUDIE 18 2.1 Bioanalytik, Ultrafiltration und Mikrodialyse 18 2.1.1 Material 18 2.1.2 Geräte 19 2.1.3 Quantifizierung von Linezolid 20 2.1.3.1 Messprinzip und Geräteaufbau 20 2.1.3.2 Probenaufarbeitung 20 2.1.3.2 Validierung 22 2.1.4 Proteinbindung von Linezolid 28 2.1.4.1 Adsorption an die Ultrafiltrationseinheit in vitro 28 2.1.4.2 Einfluss der Inkubationszeit auf die ungebundene Fraktion in vitro 28 2.1.4.3 Einfluss der Konzentration auf die ungebundene Fraktion in vitro 29 2.1.4.4 Einfluss des Antikoagulans im Blutentnahmeröhrchen auf die ungebundene Fraktion in vivo 29 2.1.5 In-vitro-Mikrodialyse mit Linezolid 29 2.1.5.1 Methoden zur Kalibrierung von Mikrodialysesonden 30 2.1.5.2 Einfluss der Flussrate auf die relative Wiederfindung 32 2.1.5.3 Einfluss der Konzentration auf die relative Wiederfindung 32 2.1.5.4 Sondenkalibrierung im Steady State 33 2.2 Klinisch-pharmazeutische Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Linezolid 34 2.2.1 Klinische Studie 34 2.2.1.1 Studiendesign und -populationen 35 2.2.1.2 Probengewinnung und -lagerung 38 2.2.1.3 Klinische Dokumentation 39 2.2.2 Individuelle pharmakokinetische Datenanalyse 40 2.2.2.1 Grafische und statistische Analyse des Datensatzes 40 2.2.2.2 Nichtkompartimentelle pharmakokinetische Auswertung 40 2.2.2.3 Kompartimentelle pharmakokinetische Auswertung 42 2.2.2.4 Berechnung pharmakodynamischer Indizes 49 2.3 Statistische Verfahren und Beurteilung 50 2.3.1 Deskriptive Statistik 50 2.3.2 Explorative Statistik 51 3\. ERGEBNISSE 54 3.1 Quantifizierung von Linezolid 54 3.1.1 Festphasenextraktionsmethode 54 3.1.2 Chromatografische Bedingungen 54 3.1.3 Validierung der quantitativen Bestimmung von Linezolid in Plasma und Mikrodialysat 54 3.1.3.1 Selektivität 54 3.1.3.2 Stabilität 56 3.1.3.3 Wiederfindung 57 3.1.3.4 Richtigkeit und Präzision 58 3.1.3.5 Kalibrierfunktion 60 3.1.3.6 Qualitätssicherung während der Messung 61 3.2 Proteinbindung von Linezolid 61 3.2.1 Adsorption an die Ultrafiltrationseinheit 61 3.2.2 Einfluss der Inkubationszeit auf die ungebundene Fraktion in vitro 61 3.2.3 Einfluss der Konzentration auf die ungebundene Fraktion in vitro 61 3.2.4 Einfluss des Antikoagulans im Blutentnahmeröhrchen auf die ungebundene Fraktion in vivo 61 3.3 In-vitro-Mikrodialyse mit Linezolid 65 3.3.1 Einfluss der Flussrate auf die relative Wiederfindung 65 3.3.2 Einfluss der Konzentration auf die relative Wiederfindung 66 3.3.3 Sondenkalibrierung im Steady State 67 3.4 Klinisch-pharmazeutische Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Linezolid 68 3.4.1 Studienpopulationen 68 3.4.2 Proteinbindung von Linezolid in vivo 72 3.4.3 In-vivo-Mikrodialyse 73 3.4.3.1 Relative Wiederfindung bei Probanden 73 3.4.3.2 Relative Wiederfindung bei Patienten 74 3.4.4 Pharmakokinetik von Linezolid bei gesunden Probanden 75 3.4.4.1 Grafische und statistische Analyse des Datensatzes 75 3.4.4.2 Nichtkompartimentelle pharmakokinetische Auswertung 78 3.4.4.3 Kompartimentelle pharmakokinetische Auswertung in Ultrafiltrat 79 3.4.4.4 Kompartimentelle pharmakokinetische Auswertung in Ultrafiltrat und Mikrodialysat 92 3.4.5 Pharmakokinetik von Linezolid bei Intensivpatienten 96 3.4.5.1 Grafische und statistische Analyse des Datensatzes 96 3.4.5.2 Nichtkompartimentelle pharmakokinetische Auswertung 98 3.4.5.3 Kompartimentelle pharmakokinetische Auswertung in Ultrafiltrat 100 3.4.5.4 Kompartimentelle pharmakokinetische Auswertung in Ultrafiltrat und Mikrodialysat 105 3.4.6 Vergleich der Pharmakokinetik von Probanden und Intensivpatienten 110 3.4.6.1 Konzentrationen in Ultrafiltrat und Interstitium 110 3.4.6.2 Kompartimentelle Auswertung in Ultrafiltrat 111 3.4.7 Pharmakodynamische Indizes 112 4\. DISKUSSION 115 4.1 Quantifizierung von Linezolid 115 4.2 Plasmaproteinbindung von Linezolid 117 4.3 In-vitro\- und In-vivo-Mikrodialyse von Linezolid 120 4.4 Pharmakokinetik von Linezolid 123 4.4.1 Pharmakokinetik von Linezolid bei gesunden Probanden 123 4.4.2 Pharmakokinetik von Linezolid bei Intensivpatienten 130 4.4.3 Pharmakodynamische Indizes 135 4.5 Perspektiven in der Dosisindividualisierung von Antibiotika 136 5\. ZUSAMMENFASSUNG 140 6\. SUMMARY 143 7\. LITERATURVERZEICHNIS 146 8\. ANHANG 157Linezolid ist der erste Vertreter einer neuen Klasse von Antibiotika, den Oxazolidinonen, und zeigt eine gute Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien. Die Substanz wird in der Praxis bei Intensivpatienten zur Therapie schwerer Infektionen z.B. durch Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme oder Vancomycin-resistente Enterokokken eingesetzt. Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses Patientenkollektiv aufgrund der komplexen pathophysiologischen Situation und umfangreicher Arzneimitteltherapie oft eine hohe inter- und intraindividuelle Variabilität der Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) von Arzneistoffen aufweist. Davon sind z.B. auch Antibiotika, insbesondere ihre Verteilung in den Interstitialraum von Geweben, betroffen. Da die meisten Bakterien im menschlichen Organismus extrazellulär vorkommen, stellt das Interstitium den eigentlichen Wirkort, die Biophase von Antibiotika dar. Werden dort nur ineffektive Arzneistoffkonzentrationen erreicht, steigt das Risiko des Therapieversagens und der Resistenzbildung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die PK von ungebundenem Linezolid in Plasma und in der Biophase von gesunden Probanden im Vergleich zu Intensivpatienten nach Einmal- und Mehrfachdosierung zu charakterisieren. Dazu wurde zunächst eine neue bioanalytische HPLC-Methode zur Quantifizierung von Linezolid in den biologischen Matrizes Plasma, Mikrodialysat und Ultrafiltrat entwickelt und nach internationalen Richtlinien validiert. Die Methode zeichnet sich durch die Verwendung minimaler Probenvolumina und eine schnelle und einfache Probenaufarbeitung aus. Für die direkte Bestimmung der ungebundenen, und damit pharmakodynamisch aktiven Linezolidkonzentrationen in der Interstitialflüssigkeit (ISF) des subkutanen Fettgewebes (s.c.) und des Skelettmuskels (i.m.) wurde die Mikrodialyse-Methode eingesetzt. Sie erlaubt eine kontinuierliche und für den Patienten wenig belastende Probensammlung. Die In-vitro-Mikrodialyseuntersuchungen mit Linezolid ergaben neben der Flussratenabhängigkeit die Konzentrationsunabhängigkeit der relativen Wiederfindung (relative recovery, RR) über einen großen Konzentrationsbereich. Auf der Basis der Ergebnisse in vitro wurden für die nachfolgende Klinische Studie die optimale Flussrate und die Länge des Probensammlungsintervalls festgelegt und die Retrodialyse-Methode als geeignetes Kalibrierverfahren für Mikrodialysesonden in vivo ausgewählt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Klinische Studie geplant und durchgeführt, in der erstmalig Linezolidkonzentrationen in der Biophase bei gesunden Probanden und Patienten mit Sepsis oder septischem Schock unter Verwendung der Mikrodialyse-Methode gemessen wurden. Anhand der differierenden Konzentrations-Zeitprofile in Plasma und in den untersuchten Interstitialräumen ließ sich ableiten, dass die ungebundenen Plasmakonzentrationen bei Intensivpatienten die tatsächliche Höhe der ISF-Konzentrationen im subkutanen Fettgewebe und im Skelettmuskel nicht wiedergeben. Um die Datenanalyse mit ungebundenen Linezolidkonzentrationen durchführen zu können, wurde die individuelle Proteinbindung von Linezolid in vivo bestimmt. Dabei zeigte sich bei Probanden und Intensivpatienten der Studie dieser Arbeit mit ~ 90 % und ~ 87 % im Vergleich zu den bisher publizierten Werten eine höhere ungebundene Fraktion. Die Ursache dieser Differenz wurde noch nicht abschließend geklärt. Im Anschluss an die nichtkompartimentelle pharmakokinetische Datenauswertung zur Bestimmung individueller Gewebepenetrationsfaktoren wurde eine Datenanalyse der ungebundenen Linezolidkonzentrationen in Plasma auf der Basis von Kompartiment-Modellen durchgeführt. Die PK-Parameter Vss/F und CL/F wurden nach Mehrfachdosierung für Probanden im Mittel mit 52 L und 5.6 L/h sowie für Intensivpatienten mit 63 L und 9.2 L/h abgeschätzt. Sie stimmten jeweils gut mit den Ergebnissen anderer Untersuchungen überein. Durch die gemeinsame Analyse der ungebundenen Plasmakonzentrationen nach iv-Infusion und po- Applikation in einem kombinierten PK-Modell wurde für jeden Probanden die individuelle Bioverfügbarkeit berechnet. Sie lag erwartungsgemäß hoch bei 99 %, jedoch zeigte ein Proband einen Wert von nur ~ 60 %. Der Vergleich der abgeschätzten PK-Parameter beider Studienkollektive dieser Arbeit ergab für Patienten in Plasma nach Mehrfachdosierung eine signifikant geringere Arzneistoffexposition, gemessen als Fläche unter der Konzentrations-Zeit- Kurve. Die Ursache dafür liegt vermutlich in der schnelleren Elimination der Substanz durch eine höhere oxidative Metabolisierung bei Intensivpatienten. Darüber hinaus zeigten Probanden nach Mehrfachdosierung eine signifikante Abnahme der Clearance von 7.5 L/h auf 5.6 L/h. Ebenso wurde bei Intensivpatienten im Verlauf der Therapie heterogene Veränderungen der PK beobachtet. In dieser Arbeit wurden für Linezolid erstmals integrierte PK- Modelle zur simultanen Berechnung von ungebundenen Konzentrationen in Plasma und in der Biophase entwickelt. Die 4-Kompartiment-Modelle beinhalteten geringfügige individuelle Strukturvariationen und beschrieben die gemessenen Linezolidkonzentrationen aller verwendeten Matrizes gut. Sie können die Basis für weitere Datenanalysen mit Hilfe populationspharmakokinetischer Modelle bilden. Linezolid penetrierte bei Probanden sehr gut in s.c.- und i.m.-ISF, bei Intensivpatienten überwiegend gut, jedoch mit hoher Variabilität. Um mögliche klinische Folgen der gemessenen ungebundenen Linezolidkonzentrationen im Plasma sowie im s.c.- und i.m.-Interstitium zu beurteilen, wurden ausgewählte pharmakodynamische Indizes unter Einbeziehung einer minimalen Hemmkonzentration (minimal inhibitory concentration, MIC90) von 4 µg/mL berechnet. Dabei zeigte sich, dass gemessen an dem Grenzwert des Parameters fAUC/MIC von 51 jeweils nur ein Patient in den Matrizes Plasma und i.m.-ISF effektive ungebundene Linezolidkonzentrationen aufwies. Unter diesen Bedingungen wurde vorgeschlagen, die tägliche Linezoliddosierung auf drei Gaben à 600 mg zu erhöhen. Bei einer MIC90 von 2 µg/mL bestand noch bei 50 % der Patienten das Risiko eines Therapieversagens wegen ineffektiver Linezolidkonzentrationen. Weitere Untersuchungen müssen jedoch klären, ob die bisher auf der Basis von Plasmakonzentrationen berechneten pharmakodynamischen Indizes auf die Verhältnisse im Interstitium übertragbar sind. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit unterscheidet sich die PK von ungebundenem Linezolid in Plasma und Interstitium bei gesunden Probanden und Intensivpatienten signifikant. Damit ist es nicht möglich, von pharmakokinetischen Daten, die bei gesunden Probanden gewonnenen wurden, auf die PK von Intensivpatienten zu schließen. Die mit Hilfe der Mikrodialyse gemessenen ungebundenen Linezolidkonzentrationen in der Biophase bilden eine sinnvolle Grundlage, die Dosierung von Linezolid bei Intensivpatienten zu individualisieren. Auf diese Weise kann die Effektivität der Linezolidtherapie gesichert und das Risiko der Resistenzentwicklung von Bakterien minimiert werden.Linezolid, the first member of a new class of antimicrobial agents, the oxazolidinones, shows good activity against grampositive bacteria. It is indicated for the treatment of serious infectious diseases in critically ill patients caused by e.g. methicillin-resistant staphylococcus aureus strains or vancomycin-resistant enterococci. Due to complex pathophysiological conditions the population of critically ill patients frequently exhibits substantial alterations in drug pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD). These conditions also affect the distribution of e.g. antiinfectives into the interstitial space fluid (ISF) of various tissues. As most of the grampositive pathogens reside in the extracellular space it is generally accepted that the ISF of tissues represents the site of action, also called biophase, for the vast majority of bacterial infections. With the lack of effective drug concentrations in the ISF the risk of treatment failure and development of bacterial resistance increases. The presented thesis aimed at characterising the PK of unbound linezolid in plasma and in the biophase of healthy volunteers and critically ill patients after single and multiple dosing. In order to quantify linezolid in the biological matrices plasma, microdialysate and ultrafiltrate a new bioanalytical HPLC method was developed and validated according to international guidelines. It was characterised by simple and rapid sample preparation procedures while only requiring minimal sample volumes. The microdialysis (MD) method was used to directly and continuously measure the unbound drug concentration in ISF of subcutaneous (s.c.) adipose tissue and of skeletal muscle (i.m.). The MD method represents a minimally invasive procedure that reduces the burden on patients to a minimum. For relative recovery (RR) in vitro MD investigations with linezolid revealed a dependence on flow rate and independence on concentration over a wide concentration range. Based on the results of the in vitro experiments the flow rate and the length of microdialysate sampling intervals were optimised. Moreover, the retrodialysis method was chosen for in vivo calibration of probes during the clinical study. In the presented thesis a clinical study was successfully planned and performed. For the first time, unbound linezolid concentrations were directly measured in the biophase of healthy volunteers as well as patients with sepsis or septic shock at steady state applying the MD method. The differing concentration-time profiles of unbound linezolid in plasma, s.c.-ISF and i.m.-ISF revealed that in critically ill patients linezolid concentrations determined in plasma did not mimic interstitial concentrations. In order to perform a PK data analysis using unbound linezolid concentrations the individual plasma protein binding (PPB) of linezolid was determined in vivo. Compared to previously published results an increased fraction unbound of linezolid was found in the presented study in both healthy volunteers (~ 90 %) and critically ill patients (~ 87 %). The reason for the difference has not been fully explained yet. After the noncompartmental PK data analysis which determined individual tissue penetration factors a data analysis based on compartment models was performed. The mean of the PK parameters Vss/F and CL/F were found to be 52 L and 5.6 L/h in healthy volunteers and 63 L und 9.2 L/h critically ill patients. The results were in good agreement with the results of previously published investigations. Based on the analysis of iv and po data in a combined PK model an individual was estimated, which as expected yielded high values of ~ 99%, however one healthy volunteer reveald a bioavailability of only ~ 60 %. Comparing the PK parameters of both study populations obtained after multiple dosing in plasma patients displayed a significantly lower drug exposition expressed as AUC. This might be due to the increased elimination of linezolid as a result of higher oxidative metabolism in critically ill patients. Healthy volunteers showed a significant decrease of clearance values after multiple dosing from 7.5 L/h to 5.6 L/h. In critically ill patients disposition characteristics changed heterogeneously. In the presented thesis integrated PK models for the simultaneous description of concentrations in plasma and in the biophase were developed for the first time. The 4-compartment models were slightly modified interindividually and described the observed concentrations in all matrices well. The models may serve as a basis for further data analysis using the population PK approach. Linezolid showed a very good distribution into the interstitium of s.c. and i.m. tissue of healthy volunteers and in general distributed well into the ISF in critically ill patients, however with high interindividual variability. In order to assess the clinical relevance of the measured linezolid concentrations in plasma and tissue interstitium some PD indices, e.g. the fAUC/MIC ratio, were calculated using a minimal inhibitory concentration (MIC90) of 4 µg/mL. As measured by the limit of the fAUC/MIC value of 51 the results indicated that only one patient achieved sufficient linezolid concentrations in plasma and i.m.-ISF. Based on these conditions a change of dosage regimen to 600 mg linezolid tid was recommended in critically ill patients. Even when assuming a MIC90 of 2 µg/mL 50% of the patients were still at risk of treatment failure due to ineffective linezolid concentrations. Further investigations will evaluate whether PD indices based on plasma concentrations may be applied to concentrations in the ISF. According to the results of the presented study the PK of unbound linezolid in plasma and interstitium significantly differs between healthy volunteers and critically ill patients. It is not possible to extrapolate PK data from healthy volunteers to critically ill patients. Linezolid concentrations in the biophase measured by means of the MD method present a valuable basis to individualise linezolid therapy in the critically ill. This more targeted therapy would ensure an effective treatment and minimise the development of bacterial resistance