A novel therapeutical approach?

Titel und Inhalt i 1. Einleitung 1 2. Zielsetzung 16 3. Material und Methoden 17 4. Ergebnisse 40 5. Diskussion 82 Anhang IBisher sind Etiologie und Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED), Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, nicht vollständig geklärt. Derzeit geht man von einem Zusammenspiel dreier Faktoren aus, die an der Entstehung und der Chronizität der Entzündung beteiligt sind: der genetischen Prädisposition, Umwelteinflüssen und immunologischen Faktoren. Da γδ T-Zellen immun-regulatorisches Potential besitzen und im Tiermodell protektive Effekte bei anderen entzündlichen Erkrankungen wie Arthritis, Diabetes und Lupus zeigten, wurde ihre Rolle bei CED näher untersucht. In verschiedenen CED- Tiermodellen (induzierbare und genetische) konnte in einem ersten Schritt gezeigt werden, dass sich eine Depletion/Defizienz der γδ T-Zellen negativ auf die Entstehung und den Verlauf einer intestinalen Entzündung auswirkt. Infolge dieser γδ T-Zelldepletion/defizienz wiesen die Tiere eine schwerwiegende Schädigung der intestinalen Mukosa auf, zeigten eine erhöhte Sekretion proinflammatorischer und eine erniedrigte Sekretion antiinflammatorischer Zytokine sowie in einigen Fällen eine erhöhte Mortalität. In einem zweiten Schritt wurde der Einfluss eines γδ T-Zelltransfers auf die Entstehung und den Verlauf der CED in einem chemisch-induzierten Tiermodell untersucht. Die transferierten γδ T-Zellen stammten entweder von Wildtyp Mäusen oder wurden aus Interleukin-10 transgenen Tieren isoliert. Unabhängig vom Spender wirkten sich die transferierten γδ T-Zellen protektiv auf die Entstehung und den Verlauf einer chemisch-induzierten Colitis aus. Die Tiere zeigten ein verlängertes Überleben, eine verminderte intestinale Schädigung und eine erhöhte Sekretion antiinflammatorischer Zytokine sowie eine erniedrigte Sekretion proinflammatorischer Zytokine. Der γδ T-Zelltransfer bei etablierter Colitis zeigte zwar keinen Einfluss auf die Mortalität, das mukosale Epithel der Tiere war jedoch weniger geschädigt als das untransferierter Tiere. Gleichzeitig war die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine erhöht, die proinflammatorischer Zytokine erniedrigt. Da sich im Tiermodell die Depletion/Defizienz von γδ T-Zellen auf das Entzündungsgeschehen bei CED negativ und der Transfer positiv bzw. protektiv auswirkt, scheinen γδ T-Zellen einen protektiven Effekt auf das mukosale Epithel sowie einen regulatorischen Effekt auf das intestinale Immunsystem auszuüben. Diese Effekte vermitteln sie vermutlich über die Regulation der Zytokindisbalance, die Suppression von unkontrolliert proliferierenden Entzündungszellen und ihre Beteiligung an der epithelialen Regeneration. Dieses Potenzial wurde in vitro näher untersucht. Es zeigte sich, dass humane γδ T-Zellen anerg sind und das Wachstum von CD4+ T-Zellen supprimieren. Diese Suppression üben sie schon in geringen Zellverhältnissen aus. Ferner sezernieren sie vernachlässigbar geringe Mengen an IL-2, jedoch große Mengen an IL-4, IL-10, TGF-β und IFN-γ. So konnte erstmals gezeigt werden, dass γδ T-Zellen sowohl protektives als auch regulatorisches Potenzial besitzen. Diese Eigenschaften machen sie für den therapeutischen Einsatz zur Behandlung von CED interessant. Einerseits proliferieren γδ T-Zellen aufgrund ihrer Anergie nicht unkontrolliert, andererseits können sie die unkontrollierte Ausbreitung autoreaktiver Entzündungszellen hemmen. Durch die Sekretion von Th2-Zytokinen und des Wachstumsfaktors TGF-β sind sie an der epithelialen Regeneration beteiligt und wirken antiinflammatorisch. Die Sekretion von IFN-γ sowie die Regulation der IFN-γ-Produktion durch αβ T-Zellen befähigt sie gleichzeitig zur Infekt- und Tumorabwehr. Daher wurde eine Anreicherung der γδ T-Zellen aus humanen Blutlymphozyten durch verschiedene Stimulationen getestet. Dabei erwiesen sich zwei Stimulationsansätze mit synthetischen Phospho-Antigenen als erfolgversprechend. Zum einen die Stimulation mit Isopentenylpyrophosphat, zum anderen die Stimulation mit Alendronat unter Th2- priming Bedingungen. In beiden Ansätzen war für eine erfolgreiche Anreicherung die Zugabe von rekombinantem IL-2 essentiell. Allerdings müssen diese Anreicherungsansätze noch optimiert werden. Zusätzlich sollte geklärt werden, ob die angereicherten γδ T-Zellen unter der Kultivierung ihren regulatorischen Phänotyp beibehalten haben. Zusammenfassend wird festgestellt, dass γδ T-Zellen einen neuen Ansatzpunkt für die Therapie von CED darstellen, jedoch weiterführende Untersuchungen hinsichtlich ihrer Generierung und ihres therapeutischen Einsatzes erforderlich sind.So far, the etiology and pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD), ulcerative Colitis and Crohn´s Disease, is unclear. At present, three factors, that is genetic predisposition, environmental influences, and immunological factors seem responsible for the development and perpetuation of intestinal inflammation. As γδ T cells possess immunoregulatory potential as well as protective effects in other animal models of inflammatory diseases e.g., arthritis, diabetes und lupus, their role in IBD was examined. First, it was shown in various IBD animal models (inducible and genetic), that the depletion of and deficiency in γδ T cells affected the development and the course of intestinal inflammation negatively. Due to γδ T cell depletion/deficiency the animals displayed a severely damaged intestinal mucosa and increased secretion of proinflammatory as well as decreased secretion of antiinflammatory cytokines with increased mortality in some cases. Second, the influence of γδ T cell transfer on the development and the course of IBD was examined in a chemically induced animal model. The γδ T cells transferred were isolated from wildtype mice or from interleukin-10 transgene animals. These γδ T cells acted independently from their origin protectively on the development and the course of chemically induced colitis. The animals showed increased survival, diminished intestinal injury, and an increased secretion of antiinflammatory cytokines as well as a decreased secretion of proinflammatory cytokines. The γδ T cell transfer at established colitis though not influencing the mortality, resulted in less damaged mucosal epithelium. Simultaneously, the secretion of antiinflammatory cytokines was increased, while the secretion of proinflammatory cytokines was decreased. As the depletion of and the deficiency in γδ cells affected the inflammation in IBD negatively, while the transfer of γδ T cells had a positive and protective effect, respectively, it seems likely, that γδ T cells have a protective effect on the mucosal epithelium as well as a regulatory effect on the intestinal immune system. These effects seem to be mediated by the regulation of the cytokine dysbalance, the suppression of uncontrolled proliferating inflammatory cells, and their involvement in epithelial regeneration. This potential was examined more closely in in vitro experiments. The in vitro data showed, that human γδ T cells are anergic and suppress the growth of CD4+ T cells. They mediate this suppressive effect even at low cell ratios. Additionally, they secrete low amounts of IL-2, but high quantities of IL-4, IL-10, TGF-β, and IFN-γ. The data presented herein showed for the first time, that γδ T cells possess both, protective and regulatory potential. These properties of γδ T cells make them an interesting candidate for IBD immunotherapy. On the one hand, due to their anergy γδ T cells do not proliferate in an autocrine fashion and are able to suppress growth of autoreactive inflammatory cells. Due to their secretion of Th2 cytokines and the growth factor TGF-β, they are involved in epithelial regeneration and act antiinflammatorily. Further, they are able to prevent infections and tumor formation due to their secretion of IFN-γ as well as their regulation of IFN-γ production by αβ T cells. Therefore, various stimulations for the enrichment of γδ T cells from human peripheral blood lymphocytes were tested. Two approaches employing synthetic phosphoantigens seem promising; the stimulation with Isopentenylpyrophosphate and the stimulation with Alendronate under Th2-priming conditions. The addition of endogenous IL-2 was essential for successful enrichment using both methods. Still, the expansion process needs further optimization. Additionally, it is necessary to clarify if the γδ T cells maintain their regulatory phenotype under these culture conditions. In summary, γδ T cells exhibit a new therapeutical approach in treatment of IBD, while further experiments regarding their generation and their therapeutical application are necessary