Influence of unfractionated and low molecular weight heparin on tumor growth in pancreatic cancer in in-vitro test

Das Pankreaskarzinom gehört zu den häufigsten malignen Neoplasien des Gastrointestinaltraktes mit der geringsten Aussicht auf Heilung. Die schlechte Prognose des Pankreaskarzinoms hängt damit zusammen, dass die Symptome erst spät auftreten. Die einzige kurative Therapie ist eine R0-Resektion, die leider nur bei weniger als 30% der Patienten möglich ist. Ist eine chirurgische Therapie mit kurativem Ansatz nicht möglich oder liegen schon Fernmetastasen vor, so bleiben nur noch palliative Therapieansätze. Thromoembolien sind häufige, zum Tod führende Komplikationen bei Krebserkrankungen. Das Pankreaskarzinom gilt als klassisches Beispiel für eine assoziierte paraneoplastische Thrombophilie. Dadurch ergibt sich häufig eine Indikation für eine prophylaktische oder therapeutische Antikoagulation. In verschiedenen Studien hatten Patienten mit begleitender Heparinmedikation unter den Tumorpatienten eine höhere mediane Überlebenszeit. Dieser Effekt scheint unabhängig von der antikoagulativen Wirkung, eine zusätzliche, eigenständige Auswirkung auf die Tumorbiologie zu repräsentieren. In verschiedenen experimentellen und klinischen Studien wurde durch die Gabe von Heparin eine Inhibierung der Metastasierung bei verschiedenen Tumoren beobachtet. Die Apoptose ist ein kontrollierter, programmierter und physiologischer Zelltod, der in einer kaskadenartig verstärkten Aktivierung von exekutierenden Enzymen, den Caspasen, abläuft. Er wird benötigt, damit in einem stabilen Gewebe ein Gleichgewicht erhalten bleibt zwischen Proliferation, der Zellerneuerung und Zelltod, der Apoptose. Eine reduzierte Apoptose spielt bei verschiedenen Tumorentitäten eine wichtige Rolle. Die entarteten Zellen bleiben durch die ausbleibende Apoptose länger am Leben, das Gewebe prolifert unkontrolliert. Es wurde analysiert, ob unfraktioniertes Heparin oder niedermolekulares Heparin einen direkten Einfluß auf das Tumorwachstum, die Apoptose und die Nekrose hat. In der hier vorliegenden Studie führten wir In-vitro-Versuche an drei verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien durch. Zwei Zelllinien stammen vom Menschen ab, die MIA PaCa-2 und die BxPC-3. Die DSL-6A/C1 Zellen stammen von der Lewis Ratte. Die Zellen wurden für die Apoptosemessung in 8 verschiedene Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 mit Aqua injektione als Kontrolle, Gruppe 2 mit 25 µM Camptothecin (CPT), DNS Topoisomerase I Inhibitor, zur Apoptoseinduktion als Positivkontrolle, die Gruppen 3 - 5 mit Heparin in den Konzentrationen 100, 400 und 1000 IE und die Gruppen 6 - 8 mit Certoparin in den Konzentrationen 100, 400 und 1000 IE. In jeder Gruppe befand sich zusätzlich Flica. Flica ist ein fluororeszensmarkiertes, nicht zelltoxisches Enzym, das die Zellmembran permeabilitiert, sich an die aktivierten Caspasen bindet, diese inhibiert und dadurch die Apoptose zum Stillstand bringt. Nach einer Inkubationszeit von zwölf Stunden, wurden die Zellen im Durchflußzytometer analysiert. Die Ergebnisse in dieser Arbeit sind sehr komplex und in jeder Zelllinie unterschiedlich. Für alle drei Zelllinien gilt, dass hohe Dosen von unfraktioniertem Heparin die Apoptose induziert und den Anteil von vitalen Zellen erniedrigt. Das niedermoleklare Certoparin hatte nur in den beiden Zelllinien MIA PaCa-2 und DSL-6A/C1 Apoptose induziert und den Anteil von vitalen Zellen erniedrigt. Bei der Nekrose konnte man keine Gemeinsamkeiten erkennen. Bei der MIA PaCa-2 sind in allen Certoparin - Gruppen und bei der hohen Dosis Heparin die Nekroserate erhöht. Bei der DSL-6A/1C sind in allen Heparin - Gruppen und in der Gruppe mit der hohen Dosis Certoparin die Nekroserate erhöht. Die Zelllinie BxPC-3 zeigte keine signifikante Änderung der Nekroserate. Bei Krebserkrankungen sind Thromboembolien häufige, oftmals zum Tod führende Komplikationen. Heparine senken die thrombotischen Ereignisse bei prophylaktischer Applikation. In verschiedenen Studien hatten Patienten mit einer Heparintherapie unter den Tumorpatienten eine höhere mediane Überlebenszeit. Dies führte zu der Hypothese, dass die durchschnittlich gesteigerte Überlebensrate nicht allein auf die Reduzierung der tödlichen Thromboembolien zurückzuführen sei. In der Literatur wird daher eine zusätzliche, spezifische Wirkung unfraktionierter und niedermolekularer Heparine auf die Karzinogenese, das Tumorwachstum, die Angiogenese, die Tumoradhäsion, -invasion und -metastasierung sowie auf antineoplastische Faktoren diskutiert, um die spezifischen Prognoseverbesserungen zu erklären. In der Literatur werden einige Studien beschrieben, in denen Heparin Apoptose induziert. Eine klare Überlegenheit vom niedermolekularen Heparin gegenüber dem unfraktionierten Heparin, wie von anderen Autoren berichtet, konnte nicht in dieser Studie beobachtet werden. In unserer Studie war die Anwendung der hohen Dosis von unfraktioniertem Heparin sogar wirkungsvoller, als die mit dem niedermolekularen Heparin. In der klinischen Anwendung limitiert die Haupteigenschaft von Heparin, die Antikoagulation, eine hohe Dosierung und Dauer einer Therapie. Um die antitumorgene Eigenschaft zu erhalten und die Antikoagulation zu minimieren, wurde in einigen Studien versucht, das Heparin zu modifizieren und zu konjugieren. Unsere Arbeit zeigt, dass die in der Literatur diskutierte spezifische Wirkung von Heparin auf die Karzinogenese, das Tumorwachstum und die Tumoradhäsion ein möglicher Mechanismus die Apoptose- und Nekroseinduktion sein könnte. Es könnte ein therapeutisches Potential von unfraktioniertem und niedermolekularem Heparin im Pankreaskarzinom geben. Weiterführende klinische Studien mit Heparin erscheinen daher ebenso notwendig wie eine Intensivierung der Grundlagenforschung zur Heparinwirkung beim Pankreaskarzinom.Pancreatic cancer is the most common malignant neoplasm of the gastrointestinal tract with the least chance of recovery. Poor prognosis of pancreatic cancer is related to the fact that it is often diagnosed at an advanced tumour stage. Thromoembolien are frequent complications leading to death in cancer. Pancreatic cancer is a classic example of an associated paraneoplastic thrombophilia. This is often an indication for prophylactic or therapeutic anticoagulation. In several studies, patients receiving heparin therapy among cancer patients have a higher median survival time. This effect seems independent of the anticoagulant effect. In various experimental and clinical studies inhibition of metastasis of different tumours has been observed by the administration of heparin. Apoptosis is a controlled, programmed, physiological cell death that occurs in a cascade of enzymes with increased activation of executioners, which is called caspases. Reduced apoptosis plays an important role in various tumour entities. The abnormal cells stay longer by the lack of apoptosis in the life and the tissue proliferate uncontrollably. It has been analysed as to whether unfractionated heparin or low molecular weight heparin have a direct influence on tumour growth. Apoptosis and necrosis do. In the present study we conducted in vitro experiments on pancreatic cancer cell lines by three different means. Two human cell lines were taken. MIA PaCa-2 cells undifferentiated human, pancreatic epithelial cells and BxPC-3 human, mucin-producing adenocarcinoma of the pancreas. One cell line of the Lewis rat, the DSL-6A/C1 cells derived from a ductal pancreatic carcinoma. The cells were divided for apoptosis measurement in eight different groups: Group 1 with Aqua injections as control, group 2 with 25 mµ.M camptothecin (CPT), DNA topoisomerase I inhibitor, to apoptosis induction as a positive control, groups 3-5 with heparin in the concentrations 100, 400 and 1000 IU and group 6-8 with Certoparin in the concentrations of 100, 400 and 1,000 IU in each group was additionally Flica. FLICA™ is a Fluorescent-Labeled Inhibitor of Caspases, which binds to the activated caspases, and thus inhibits the apoptosis to a standstill. After an incubation period of twelve hours in an incubator at 37 ° C with 5% CO2, the cells were analysed with flow cytometry. The results in this work are very complex and different in each cell line. All three cell lines showed that high doses of unfractionated heparin induced apoptosis and the percentage of viable cells decreased. The low molecular weight heparin (Certoparin) induces apoptosis in high doses only in the two cell lines MIA PaCa-2 and DSL-6A/C1 and the proportion of viable cells decreased. During necrosis one could not see any similarities. In MIA PaCa-2 in all Certoparin - groups and in the high dose heparin the necrosis increased. In DSL-6A/1C in all heparin - groups and in the high dose of Certoparin the necrosis increased. The cell line BxPC-3 showed no significant change in necrosis. The high doses of both substances, with the exception of the high dose Certoparin in BxPC-3, induces apoptosis and necrosis. In our study, the application of high doses of unfractionated heparin was even more effective than the low with the heparin. In clinical applications the main property of heparin limits the anticoagulation, a high dosage and duration of treatment. Getting the anti tumorigenic property and minimising the anticoagulation were attempted in some studies to modify the heparin and to conjugate. Our study shows that in the literature discussed specific effect of heparin on carcinogenesis, tumour growth and Tumoradhäsion a possible mechanism could be explained by inducing apoptosis and necrosis. There could be a therapeutic potential of unfractionated and low molecular weight heparin in pancreatic cancer. Further clinical studies with heparin appear therefore as necessary as an intensification of basic research to the heparin effect in pancreatic cancer