die Rolle der Transkriptionsfaktoren Rbp-j und Olig3

1 . INTRODUCTION 1-16 1.1 . Patterning of the central nervous system 1 1.1.1 . Anterior-posterior patterning 1 1.1.2 . Dorsal-ventral patterning of the spinal cord 3 1.2 . Neuronal subtypes of the dorsal spinal cord and hindbrain 5 1.2.1 . Early-born neurons of the dorsal spinal cord and hindbrain 6 1.2.2 . Late-born neurons of the dorsal spinal cord and hindbrain 8 1.3 . The role of bHLH transcription factors in the specification of neurons 10 1.3.1 . The Olig3 bHLH transcription factor 10 1.3.2 . Ptf1a function in the nervous system 11 1.4 . Functions of the Notch pathway in the neural development 13 1.4.1 . Rbp-j function in the Notch pathway 13 1.5 . Aims 16 2 . MATERIALS AND METHODS 17-35 2.1 . Abbreviations 17 2.2 . Materials 19 2.2.1 . Chemicals 19 2.2.2 . Bacterial strains 19 2.2.3 . Vectors 19 2.2.4 . Antibodies 20 2.2.5 . Riboprobes for in situ hybridization 20 2.2.6 . Cell lines 21 2.2.7 . Chicken strains 21 2.2.8 . Mouse strains 21 2.2.9 . Bacteria culture 22 2.2.10 . Cell culture media 23 2.3 . Methods 24 2.3.1 . Preparation of plasmids and DNA fragments 24 2.3.2 . Restriction hydrolysis of DNA, ligation of DNA fragments and transformation into bacteria 24 2.3.3 . Homologous recombination in bacteria 25 2.3.4 . DNA sequencing 25 2.3.5 . Polymerase chain reaction 26 2.3.6 . Isolation of genomic DNA from mouse tissue 28 2.3.7 . Isolation of genomic DNA from ES cells 28 2.3.8 . Southern blot 29 2.3.9 . Fibroblast cell culture 30 2.3.10 . ES cell culture, transfection and selection 30 2.3.11 . Blastocyst injection 31 2.3.12 . In ovo electroporation 31 2.3.13 . Preparation of riboprobes for in situ hybridization 32 2.3.14 . Preparation of frozen sections 32 2.3.15 . Immunohistochemistry 33 2.3.16 . X-Gal staining 33 2.3.17 . In situ hybridization 34 2.3.18 . Tamoxifen gavaging 35 2.3.19 . Program for counting cell nuclei 35 3 . RESULTS 36-64 3.1 . Rbp-j function in the dorsal spinal cord 36 3.1.1 . Effect of Rbp-j mutation on neurogenesis 37 3.1.2 . The role of Rbp-j in the specification of early-born neurons 40 3.1.3 . Analysis of Rbp-j function in the specification of dILA and dILB neurons 43 3.2 . Olig3 function in the hindbrain 46 3.2.1 . Generation of mouse strains that carry Cre sequences in the Olig3 locus 46 3.2.2 . Olig3 expression in the alar plate of the hindbrain and characterization of neuron subtypes arising from the Olig3+ domain 49 3.2.3 . Analysis of rhombomeres 4-7 of Olig3 mutant mice 53 3.2.4 . Derivatives of Olig3+ cells in the hindbrain and genetic lineage tracing in homozygous Olig3 mutant mice 56 3.2.5 . The role of Olig3 in the development of dA4 and dA3 neurons 60 4 . DISCUSSION 65-77 4.1 . Rbp-j functions in the dorsal spinal cord 65 4.1.1 . Two distinct roles of Rbp-j in the dorsal spinal cord 66 4.1.2 . Evolution of the Notch-independent Rbp-j function 70 4.2 . The Olig3 function in the dorsal hindbrain 72 4.2.1 . Derivatives of the Olig3+ progenitor domain 72 4.2.2 . The function of Olig3, Ptf1a and Lbx1 in the determination of dorsal neuron types 73 4.2.3 . A similar role of Olig3 in the dorsal spinal cord and hindbrain 75 4.2.4 . Major function of Olig3 in the specification of neuronal types 76 5 . SUMMARY 78-80 ZUSAMMENFASSUNG 79 6 . BIBLIOGRAPHY 81-90Correct function of neural networks depends on a balance of inhibitory and excitatory activity. The balance is initially generated through the determination of inhibitory and excitatory neuronal fates controlled by transcription factors. A first goal in my thesis was to define if Notch, which controls asymmetric divisions in other systems, plays a role in the determination of inhibitory and excitatory fates in the dorsal spinal cord. To address this, I employed genetic analysis in mice and used two transgenic mouse models. In the first, a dominant-negative variant of Mastermind-like1 (dnMaml) was expressed in an inducible manner, which inhibits the transcriptional response to Notch signaling. In the second, I employed conditional mutagenesis of Rbp-j, the major transcriptional mediator of the Notch pathway. In Rbp-j and dnMaml mutant mice, I observed a depletion of the progenitor domain in the dorsal spinal cord, consistent with the known function of Notch signaling in the maintenance of neuronal progenitors. I also found that the GABAergic neurons were not formed in Rbp-j mutant mice, but this effect was not observable in the dnMaml mutants. Independent studies in Jane Johnson’s laboratory described a similar function for the bHLH factor Ptf1a, which is a component of the PTF1 transcriptional complex. My results together with those of Jane Johnson indicate that Rbp-j functions independently of Notch in this PTF1 complex. A second goal was the analysis of the bHLH transcription factor Olig3 that is expressed in the ventricular zone of the dorsal alar plate of the hindbrain. For this, I generated two new mouse strains, Olig3Cre and Olig3CreERT2, and used these for genetic fate mapping. I found that the Olig3+ progenitor domain gives rise to several neuronal types in the dorsal alar plate of the hindbrain, which contribute to the nucleus of the solitary tract and to precerebellar nuclei. In Olig3 mutant mice, the nucleus of the solitary tract did not form, and precerebellar nuclei were absent or smaller. My further work that relies on overexpression experiments in the chick hindbrain showed that Olig3 and Ptf1a together induce the fate of climbing fiber neurons of the inferior olivary nucleus. However, analysis of Olig3/Lbx1 double mutant mice demonstrated that Olig3 exerts its role solely by suppressing Lbx1 in specification of climbing fiber neurons. In contrast, analysis of Olig3/Ptf1a double mutant mice revealed that Olig3 has an instructive role in the determination of noradrenergic neurons of the nucleus of the solitary tract.Die korrekte Funktion neuronaler Netzwerke beruht auf einem Gleichgewicht zwischen hemmenden und aktivierenden Impulsen. Dieses Gleichgewicht wird ab initio durch Transkriptionsfaktoren hergestellt, die den inhibitorischen bzw. exzitatorischen Charakter neuronaler Zellen festlegen. Als erstes Ziel meiner Promotionsarbeit habe ich im Modellorganismus Maus untersucht, ob der Notch- Rezeptor, der in anderen Systemen asymmetrische Zellteilung steuert, diese Funktion auch bei der Determinierung hemmender und aktivierender Neurone im dorsalen Rückenmark ausübt. In der ersten von zwei verwendeten transgenen Mauslinien wurde eine dominant-negative Variante von Mastermind-like1 (dnMaml) induzierbar exprimiert, um so die Notch-abhängige transkriptionelle Aktivierung zu hemmen. In der zweiten Mauslinie wurde Rbp-j, der wichtigste Transkriptionsfaktor im Notch-Signalweg, konditionell mutiert. In beiden Mauslinien fand ich, in Übereinstimmung mit der beschriebenen Rolle von Notch bei der Erhaltung von Vorläuferzellen, eine Minderung der Vorläuferdomäne im dorsalen Rückenmark. GABAerge Neurone fehlten in den Rbp-j-, nicht jedoch in den dnMaml-Mäusen. Unabhängige Untersuchungen aus dem Labor von Jane Johnson zeigten eine ähnliche Funktion für den bHLH Transkriptionsfaktor Ptf1a, einen Bestandteil des PTF1 Transkriptionsfaktorkomplexes. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, daß Rbp-j eine Notch-unabhängige Funktion im PTF1-Komplex ausübt. Ein zweites Ziel meiner Dissertation war die Analyse des bHLH Transkriptionsfaktors Olig3, der in der Ventrikulärzone der dorsalen Alarplatte des Rhombenzephalon exprimiert wird. Ich habe dafür zwei neue Mauslinien etabliert, Olig3Cre und Olig3CreERT2, die ich zur genetischen Zellschicksalsanalyse eingesetzt habe. Ich fand, daß die Olig3+ Vorläuferdomäne verschiedene Neuronentypen in der dorsalen Alarplatte des Rhombenzephalon hervorbringt, die zum Nucleus solitarius und zu präzerebellaren Kernen beitragen. In Olig3 mutanten Mäusen wurde der Nucleus solitarius nicht gebildet, die präzerebellaren Kerne waren reduziert oder fehlten. Weiterführende Arbeiten im Hühnchen zeigten, daß Olig3 und Ptf1a zusammen die Kletterfasern des Nucleus olivarius inferior induzieren. Die Analyse dieser Fasern in Olig3/Lbx1 Maus-Doppelmutanten ergab, daß Olig3 hier auschließlich über die Unterdrückung von Lbx1 wirkt. In Olig3/Ptf1a Doppelmutanten hat Olig3 hingegen eine aktive Rolle in der Determinierung noradrenerger Neurone des Tractus solitarius