Antimicrobial and antiviral proteins in chronic inflammatory skin diseases and their regulation by cytokines

Chronisch-inflammatorische Hauterkrankungen sind häufig mit einer gestörten Permeabilitätsbarriere der Haut assoziiert, welche für ein Eindringen von Pathogenen prädestiniert. Tatsächlich sind verschiedene Dermatosen wie atopische Dermatitis (AD), Acne inversa (AI) und Mycosis fungoides (MF) mit einem erhöhten Risiko für Hautinfektionen verbunden. In seltenen Fällen einer systemischen Ausbreitung können diese für die Betroffenen sogar lebensbedrohlich werden (Ekzema herpeticatum bei AD und MF, bakterielle Sepsis im Spätstadium der MF). Durch die immunstimulierenden Effekte mikrobieller/viraler Bestandteile spielen Infektionen außerdem vielfach eine pathogenetische Rolle bei den Hauterkrankungen. Interessanterweise zeigt jedoch eine weitere Hauterkrankung, die Psoriasis, sehr geringe Hautinfektionsraten, welche mit denen gesunder Probanden vergleichbar sind, und nimmt somit in Hinblick auf die hier scheinbar adäquate antimikrobielle/antivirale Kompetenz der Haut eine Sonderstellung ein. Vorangegangene Studien zu den Ursachen der bakteriellen Infektionsresistenz der psoriatischen Haut demonstrierten eine im Vergleich zur erkrankten Haut von AD-Patienten massive lokale Produktion antimikrobieller Proteine (AMPs). Über die Ursachen der viralen Infektionsresistenz der psoriatischen Haut war bislang nichts bekannt. Vor diesem Hintergrund entstand die vorliegende Arbeit, welche die Charakterisierung der kutanen Produktion von sowohl AMPs als auch antiviralen Proteinen (AVP) bei chronisch-entzündlichen Dermatosen und die Aufklärung deren Regulierung durch Inflammationsmediatoren (Zytokine) zum Ziel hatte. Bei der vergleichenden Untersuchung der verschiedenen Patientengruppen stellten wir fest, dass obgleich die läsionale Haut von Patienten mit AD, AI und MF gegenüber der Haut gesunder Probanden eine klar gesteigerte AMP-Expression zeigte, diese Steigerung im Vergleich zur psoriatischen Haut stark limitiert war. Besonders deutlich war dieses Phänomen bei der AI und der MF ausgeprägt. Als essentiellen Induktor der kutanen AMP-Expression identifizierten wir das – wie wir heute wissen - von TH22- und TH1-Zellen sowie lymphoiden Zellen des angeborenen Immunsystems (ILC3) gebildete Zytokin IL-22. IL-22 zeigte hohe Expressionslevel in psoriatischer Haut, welche mit der Stärke der jeweiligen AMP-Expression korrelierten. Tatsächlich war IL-22 in der Lage, die Expression verschiedener AMPs wie beta-Defensine und S100A-Proteine in den als IL-22-Zielzellen identifizierten Keratinozyten zu induzieren. Zusätzlich zu seiner direkten Wirkung beobachteten wir die Induktion eines sehr ähnlich wirkenden Mediators in den Keratinozyten, dem IL-20, der somit potentiell die IL-22-Wirkung unterstützt. Passend zu seiner Funktion als AMP-Induktor demonstrierten weitere Untersuchungen, dass IL-22 im Körper vornehmlich auf Epithelzellen an Barriereorganen wirkt. Dagegen waren Immunzellen überraschenderweise nicht durch IL-22 beeinflussbar, was strikt genommen diesen Mediator als ‚Interleukin‘ disqualifiziert. Vergleichende Expressionsstudien bei unterschiedlichen Dermatosen zeigten, dass AI-Patienten gegenüber Psoriasispatienten tatsächlich geringe kutane Level an IL-22 und seines downstream Mediators IL-20 produzieren, während die Expression anderer AMP-Induktoren vergleichbar war. AI-Patienten zeigten außerdem eine verminderte läsionale Expression der zellulären IL-22/IL-20-Rezeptorkomponenten bei gleichzeitig erhöhter Expression des natürlichen IL-22-Inhibitors, dem IL-22BP. Somit scheint bei der AI nicht nur die kutane Produktion sondern auch die Wirksamkeit von IL-22 selektiv eingeschränkt. Im Gegensatz zur AI waren jedoch die IL-22-Level der läsionalen Haut von Patienten mit AD und MF mit denen von Psoriasispatienten durchaus vergleichbar, was andere Ursachen der unzureichenden kutanen AMP-Produktion dieser Patienten nahelegte. Tatsächlich konnten wir für diese beiden Erkrankungen stattdessen eine relative Defizienz des TH17-Zell/ILC3-Mediators und AMP-Induktors IL-17 aufzeigen. Ähnlich IL-22 war IL-17 in der Lage, die keratinozytäre Expression verschiedener AMPs massiv zu induzieren. Daneben war die läsionale Expression des TH2-Zytokins IL-13, welches bekanntermaßen in der Lage ist, die epitheliale AMP-Expression zu hemmen, bei AD- und MF-Patienten erhöht. Die Daten zeigen somit, dass die starke antimikrobielle Kompetenz der psoriatischen Haut mit einer massiven Expression einer Reihe von AMP-Induktoren inklusive IL-22 und IL-17 assoziiert ist. Dagegen fand sich bei Patienten mit AD, AI und MF eine unzureichende Produktion von entweder IL-22/IL-20 (AI) oder von IL-17 bei gleichzeitig deutlicher IL-4/IL-13-Produktion (AD, MF). Dieses deutet klar darauf hin, dass trotz der Redundanz verschiedener AMP-induzierender Zytokine, einzelnen dieser Mediatoren eine essentielle Rolle bei der Sicherung einer ausreichenden antimikrobiellen Kompetenz bei chronischer Hautinflammation zukommt. Dieses Konzept ließ sich durch in vitro-Studien untermauern, welche zeigten, dass bei Stimulierung isolierter Keratinozyten durch ein Gemisch verschiedener AMP-induzierender Zytokine die resultierende AMP-Induktion jeweils bei Wegfall von IL-17 oder IL-22 zusammenbricht. Bei der Suche nach den Ursachen der unzureichenden Produktion von IL-22 (AI) bzw. IL-17 (AD und MF) stießen wir auf Hinweise, die gegen eine reduzierte Anzahl IL-22- bzw. IL-17-produziernder Lymphozyten in der Haut dieser Patienten gegenüber der von Psoriatikern sprachen. Stattdessen entdeckten wir eine Rolle von IL-4/IL-13 und IL-10: IL-10, dessen starke Expression wir in AI aufzeigen konnten, hemmte die lymphozytäre Produktion von IL-22. Demgegenüber waren die für AD und MF prototypischen TH2-Zell-Zytokine IL-4 und IL-13 in der Lage, die IL-17-Produktion der TH17-Zellen zu reduzieren. Neben der Aufklärung der Regulation der mikrobiellen Infektionsabwehr widmeten wir uns der antiviralen Kompetenz der Haut der Patienten mit chronischer Hautentzündung. In Expressionsstudien fanden wir massive epidermale Level von AVPs in der läsionalen Haut der Psoriasispatienten im Vergleich zur Haut gesunder Spender als auch im Vergleich zur Haut von AD-Patienten. Als der die AVP-Produktion der psoriatischen Haut verursachende Stimulus wurde IL-29 identifiziert. Während IL-29 deutlich in der psoriatischen Haut exprimiert war und als einziger Mediator eine überzeugende Korrelation mit den AVP-Expressionen zeigte, war dieses Zytokin in der Haut der AD-Patienten nicht nachweisbar. Stimulationsexperimente in vitro zeigten die potente AVP-Induktion von IL-29 in Keratinozyten, welche mit dem Schutz der Zellen vor einer Herpes-simplex-Virus-Infektion einherging. Weiterhin ließ sich durch IL-29-Neutralisierung eine Reduktion der AVP-Expression in Proben der den Psoriasispatienten entnommenen läsionalen Haut erzielen. Im Gegensatz zu IL-29 waren Typ-1-IFNs, welche als klassische AVP-Induktoren bekannt sind, in den psoriatischen Läsionen nicht nachweisbar, was eine ursächliche Beteiligung dieser Zytokine ausschließt. Für das Verständnis der IL-29-Rolle wurde nach weiteren Zielzellen des Zytokins gesucht. Unter den verschiedenen Gewebszellen der Haut zeigten neben Keratinozyten auch Melanozyten eine Reaktion auf IL-29-Exposition. Die Analyse verschiedener Immunzelltypen demonstrierte überraschenderweise, dass diese trotz Expressionsnachweis des spezifischen IL-29-Rezeptors nicht durch das Zytokin beeinflussbar waren, was möglicherweise mit deren Expression einer inhibitorischen Rezeptorvariante im Zusammenhang steht. Weitere Untersuchungen identifizierten TH17-Zellen als wichtige Produzenten von IL-29 in psoriatischer Haut. Die starke Fähigkeit der TH17-Zellen zur IL-29-Produktion, AVP-Induktion und anti-viralen Abwehr konnte in vitro bestätigt werden und enthüllte somit eine völlig neue Funktion dieser Zellen. Wie die IL-17-Produktion dieser Zellen, so war auch ihre IL-29-Produktion durch die für AD und MF relevanten Zytokine IL-4/IL-13 hemmbar, währenddessen diese Zytokine keinen direkten Einfluss auf die keratinozytäre AVP-Produktion ausübten. Weitere Studien sind notwendig, die antivirale Kompetenz in der Haut von Patienten mit AI und MF und die Rolle von ILCs bei der IL-29-Produktion zu charakterisieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass bei der epidermalen Produktion der AMPs und AVPs spezifischen TH-Zell/ILC-Zytokinen eine essentielle Rolle zukommt, und die unzureichende Produktion dieser Zytokine mit einem erhöhten kutanen Infektionsrisiko bei entzündlichen Dermatosen assoziiert ist. Die Erkenntnisse bilden somit einen Meilenstein im Verständnis der first-line Infektionsabwehr der Epidermis und ebnen nicht nur den Weg für die Entwicklung therapeutischer Ansätze mit hohem Sicherheitsprofil, sondern auch für die Charakterisierung der Prozesse an anderen Barriereorganen.Chronic inflammatory skin diseases are often associated with a disturbed permeability barrier of the skin, which predestines for invasion of pathogens. In fact, various dermatoses such as atopic dermatitis (AD), acne inversa (AI) and mycosis fungoides (MF) are associated with an increased risk of skin infections. In rare cases of systemic spread, these can even become life-threatening for affected patients (eczema herpeticatum in AD and MF, bacterial sepsis in the late stages of MF). Due to the immunostimulatory effects of microbial / viral components, infections also play a pathogenetic role in skin diseases. Interestingly, however, another skin disease, psoriasis, shows very low skin infection rates, comparable to those of healthy volunteers, and thus holds a special position in terms of the apparently adequate antimicrobial / antiviral competence of the skin. Previous studies on the causes of bacterial infection resistance of the psoriatic skin demonstrated massive local production of antimicrobial proteins (AMPs) compared to diseased skin of AD patients. Nothing was known so far about the causes of the viral infection resistance of psoriatic skin. In view of the above, the present work was designed to characterize the cutaneous production of both AMPs and antiviral proteins (AVP) in chronic inflammatory dermatoses and to elucidate their regulation by inflammatory mediators (cytokines). In the comparative study of the different groups of patients, we found that although the lesional skin of patients with AD, AI and MF showed markedly increased AMP expression compared to the skin of healthy volunteers, this increase was severely limited compared to psoriatic skin. This phenomenon was particularly pronounced in AI and MF. As an essential inducer of cutaneous AMP expression, we identified the cytokine IL-22, which is produced by TH22 and TH1 cells as well as by lymphoid cells of the innate immune system (ILC3). IL-22 showed high levels in psoriatic skin, which correlated with the strength of the respective AMP expression. IL-22 was able to induce the expression of various AMPs such as beta-defensins and S100A proteins in the keratinocytes identified as IL-22 target cells. In addition to its direct effect, we observed the induction of a very similar mediator in the keratinocytes, the IL-20, which thus potentially supports the IL-22 effect. Consistent with its role as an AMP inducer, further studies demonstrated that IL-22 acts primarily on epithelial cells of barrier organs. Surprisingly, immune cells were not affected by IL-22, which strictly disqualifies this mediator as 'interleukin'. Comparative expression studies in different dermatoses showed that AI patients actually produced low cutaneous levels of IL-22 and its downstream mediator IL-20 compared to psoriasis patients, while the expression of other AMP inducers was comparable. AI patients also showed decreased lesional expression of cellular IL-22 / IL-20 receptor components with concomitantly increased expression of the natural IL-22 inhibitor, IL-22BP. Thus, in AI, not only cutaneous production but also the efficacy of IL-22 appears to be selectively restricted. However, in contrast to AI, the lesional IL-22 levels of patients with AD and MF were quite similar to those of psoriasis patients, suggesting other causes of inadequate cutaneous AMP production by these patients. We were able to show a relative deficiency of the TH17 cell / ILC3 mediator and AMP inducer IL-17 for these two diseases instead. Similar to IL-22, IL-17 massively induces the keratinocyte expression of various AMPs. In addition, lesional expression of the TH2 cytokine IL-13, which is known to inhibit epithelial AMP expression, was increased in AD and MF patients. The data thus show that the strong antimicrobial competence of psoriatic skin is associated with massive expression of a number of AMP inducers including IL-22 and IL-17. In contrast, in patients with AD, AI and MF, there was insufficient production of either IL-22 / IL-20 (AI) or IL-17 with parallel significant IL-4 / IL-13 production (AD, MF). This clearly indicates that, despite the redundancy of various AMP-inducing cytokines, some of these mediators play an essential role in ensuring adequate antimicrobial competence in chronic skin inflammation. This concept was substantiated by in vitro studies, which showed that when isolated keratinocytes were stimulated by a mixture of different AMP-inducing cytokines, the resulting AMP induction broke down when IL-17 or IL-22 was omitted. In searching for the causes of inadequate production of IL-22 (AI) and IL-17 (AD and MF), we found evidence against a reduced number of IL-22- or IL-17-producing lymphocytes in these patients' skin compared to that of psoriasis patients. Instead, we discovered a role for IL-4 / IL-13 and IL-10: IL-10, whose strong expression we were able to demonstrate in AI, inhibited the lymphocytic production of IL-22. In contrast, IL-4 and IL-13, two TH2-cell cytokines prototypical for AD and MF, were able to reduce the IL-17 production of TH17 cells. Having clarified the regulation of the microbial infection defense, we investigated the antiviral competence of the skin of patients with chronic inflammatory skin diseases. In expression studies, we found massive epidermal AVP levels in the lesional skin of psoriasis patients compared to the skin of healthy donors and AD patients. As the stimulus causing AVP production of the psoriatic skin, IL-29 was identified. While IL-29 was clearly expressed in the psoriatic skin and was the only mediator to show a convincing correlation with AVP expression, this cytokine was undetectable in the skin of AD patients. Stimulation experiments in vitro demonstrated the potent AVP induction in keratinocytes of IL-29, which was associated with the protection of these cells from herpes simplex virus infection. Furthermore, IL-29 neutralization reduced AVP expression in samples of lesional skin taken from psoriasis patients. In contrast to IL-29, type 1 IFNs, which are known to be classical AVP inducers, were undetectable in psoriatic lesions, ruling out any causative involvement of these cytokines. For the understanding of the IL-29 role, further target cells of the cytokine were searched for. Among the various tissue cells of the skin, keratinocytes as well as melanocytes showed a clear response to IL-29 exposure. The analysis of different types of immune cells surprisingly demonstrated that - despite expression of the specific IL-29 receptor - they were not influenced by the cytokine, which may be related to their expression of an inhibitory receptor variant. Further investigations identified TH17 cells as important producers of IL-29 in psoriatic skin. The strong capacity of TH17 cells to produce IL-29, to induce AVPs and to increase the anti-viral defense could be confirmed in vitro, thus revealing a completely new function of these cells. Like the IL-17 production of these cells, their IL-29 production was inhibited by IL-4 / IL-13, i.e., cytokines relevant for AD and MF. In contrast, these cytokines had no direct influence on keratinocytic AVP production. Further studies are needed to characterize the antiviral competence in the skin of patients with AI and MF and the role of ILCs in the IL-29 production. In summary, specific TH cell / ILC cytokines play an essential role in the epidermal production of AMPs and AVPs. An inadequate production of these cytokines is associated with an increased cutaneous risk of infection in inflammatory dermatoses. The findings thus represent a milestone in the understanding of the first-line infection defense of the epidermis and pave the way not only for the development of therapeutic approaches with a high safety profile, but also for the characterization of respective processes at other barrier organs