Gene expression of endothelial cells under shear stress

Titelblatt 1 1. Einleitung 7 1.1. Blutströmung, Endothelzelle und Gefäßadaptation 7 1.1.1. Auf die Endothelzelle wirkende biomechanische Kräfte 7 1.1.2 Modelle zur Untersuchung wandschubspannungsabhängiger Effekte 9 1.1.3. Kurzfristige strömungsvermittelte Anpassungsvorgänge 10 1.1.4. Langfristige strömungsvermittelte Anpassungsvorgänge 12 1.1.5. Optimierung realer Gefäßnetzwerke 14 1.2. Hämodynamik und Genexpression 16 1.2.1. Mechanotransduktion in Endothelzellen 16 1.2.2. Mechanosensitive Genexpression in Endothelzellen 19 1.3. Strömungsinduzierte Gene 22 1.4. Fragestellung 26 2. Material und Methoden 27 2.1. Material 27 2.1.1. Chemikalien und Verbrauchsmaterial 27 2.1.2 Geräte 29 2.1.3. Kits 30 2.2. Methoden 31 2.2.1. Isolierung und Kultivierung von HUVEC 31 2.2.2. Stimulation der Endothelzellen durch Wandschubspannung 34 2.2.3. Zellernte 42 2.2.4. RNA-Isolierung 42 2.2.5. Differential Display RT-PCR 43 2.2.6. Isolierung und Reamplifikation differentiell exprimierter Banden 47 2.2.7. Sequenzierung der Amplifikationsprodukte 49 2.2.8. Semiquantitative RT-PCR 52 2.2.9. Northern blot 54 2.2.10. Statistische Auswertung 59 3\. Ergebnisse 60 3.1. Reaktion von Endothelzellkulturen auf Wandschubspannung 60 3.2. Nach Strömungsexposition differentiell exprimierte mRNA in Endothelzellen 62 3.3. Reamplifikation differentiell exprimierter mRNA-Fragmente 67 3.4. Sequenzanalysen differentiell exprimierter mRNA-Fragmente 69 3.5. Homologien der mRNA-Fragmente zu publizierten Sequenzen 78 3.6. Verifizierung der Ergebnisse durch semiquantitative RT-PCR 87 3.7. Verifizierung der Ergebnisse durch northern blot 94 4. Diskussion 96 4.1. Simulation vaskulärer Flußbedingungen 96 4.2. Analyse differentieller Genexpression durch Differential Display RT-PCR 98 4.3. Strömungsregulierte Gene 100 4.3.1. Angiopoietin-2 100 4.3.2. Decidual protein induced by progesterone (DEPP) 107 4.3.3. METH-1 107 4.3.4. gas-3/PMP-22 112 4.3.5. p11 117 4.4. Ausblick 120 Abkürzungsverzeichnis 121 Abbildungsverzeichnis 123 Tabellenverzeichnis 124 Literaturverzeichnis 125 Lebenslauf 143 Danksagung 144Angiogenese und vaskuläres Remodeling sind nur unzureichend verstanden. Gesichert ist jedoch, daß die auf die Gefäßendothelzellen wirkende Blutströmung Morphologie, Neogenese und Regression von Gefäßen entscheidend mitbestimmt. Um dieser Angioadaptation zugrunde liegende Mechanismen zu identifizieren, war es das Ziel der vorliegenden Untersuchung, endotheliale Gene mit strömungsabhängiger Expression zu finden. Hierzu wurden Endothelzellen aus Nabelschnurvenen in einem Kegel-Platte-System 24 Stunden einer nicht-laminaren Strömung von 5,4 dyn/cm2 ausgesetzt. Die Genexpression wurde mittels Differential Display RT-PCR analysiert, die Verifizierung der Ergebnisse erfolgte durch semiquantitative RT-PCR und northern blot. Von 33 differentiell exprimierten mRNA-Fragmenten konnten 16 reamplifiziert und sequenziert werden. Sechs Sequenzen sind homolog zu den publizierten mRNA- Sequenzen der Gene Angiopoietin-2, Decidual proteine induced by progesterone, METH-1, gas-3/PMP-22 und h-Calpactin-1/p11. Durch Wandschubspannung wurde die Expression der mRNAs für Angiopoietin-2 inhibiert, die Expression der mRNAs für Decidual proteine induced by progesterone, METH-1, gas-3/PMP-22 und h-Calpactin-1/p11 wurde dagegen induziert. Die Produkte der aufgezählten mRNAs haben bekannterweise antiangiogene, adhäsive, proteolytische und zellregulatorische sowie zahlreiche weitere funktionelle Eigenschaften. Obgleich die Beteiligung einiger dieser Substanzen bei der Angioadaptation bereits vermutet wurde, erfolgt in der vorliegenden Arbeit der erstmalige Nachweis der Aktivierung bzw. Deaktivierung ihrer Gene durch Strömung. Die Resultate stellen eine wichtige Innovation für das Verständnis verschiedener hämodynamischer Situationen (z.B. Wundheilung, Stenose und Shuntbildung) dar und und legen neue Prinzipien bei der physiologischen und pathophysiologischen vaskulären Adaptation nahe.Blood flow over endothelial cells is known to have a crucial role in determining morphology, neogenesis and regression of blood vessels. To identify mechanisms that mediate flow dependent angioadaptation, the aim of this work was to find endothelial genes with flow dependent expression. In a cone and plate viscometer endothelial cells were exposed to non-laminar flow (5,4 dyn/cm2) for 24 hrs. Gene expression was analysed by Differential Display RT-PCR, the results were verified by semiquantitative RT-PCR and northern blotting. There were 33 differentially expressed bands, 16 of these 33 bands were reamplified and sequenced successfullly. 6 sequences showed significant homology to the known mRNAs of Angiopietin-2, Decidual proteine induced by progesterone, METH-1, gas-3/PMP-22 und h-Calpactin-1/p11. The expression of Angiopoietin-2 was downregulated, the expression of Decidual proteine induced by progesterone, METH-1, gas-3/PMP-22 und h-Calpactin-1/p11 was upregulated. The gene products of these mRNAs have antiangiogenic, adhesive, proteolytic, cell-regulatoric and numerous other functional properties. Eventhough the participation of these substances in Angioadaptation alreaday has been assumed, in this work the flow-dependent activation respectively deactivation was shown for the first time. The results represent an important step in understanding different hemodynamic situations (e.g wound healing, stenosis and shunt formation) und suggest new principles in physiologic and pathophysiologic vascular adaptation