Expression analysis of the two potential tumor suppressor genes H-REV 107-2/TIG3 und MUC18/MelCAM in human ovarian carcinoma cell lines an ovarian carcinomas

Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Danksagung und Lebenslauf 1\. Einleitung 2\. Materialien und Methoden 3\. Ergebnisse 4\. Diskussion 5\. Zusammenfassung 6\. LiteraturverzeichnisZiel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Frage, ob H-REV107-2 und MUC18 im Ovarialepithel als Tumor-Suppressor-Gene in Betracht kommen. Die Expression beider Gene wurde in sieben Ovarialkarzinom-Zelllinien, einer Ovarialepithel-Zelllinie und mehreren Ovarialkarzinomen auf mRNA-Ebene untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss einer Überexpression beider Gene auf das Wachstum in den Zelllinien A27/80 und OVCAR-3 untersucht. H-REV107-2 ist ein durch Retinsäure induzierbares Gen, welches in der Literatur bereits mehrfach als Klasse II Tumor-Suppressor-Gen beschrieben wurde. Über seine Expression im Ovarialkarzinom war bis zum jetzigen Zeitpunkt noch nichts bekannt. Die Analyse der H-REV107-2 Expression zeigte, dass H-REV107-2 im normalen Ovarialepithel in vitro exprimiert wird. In vier der sieben Ovarialkarzinom-Zelllinien konnte keine und in neun der 21 untersuchten Ovarialkarzinome eine stark verminderte H-REV107-2 Expression nachgewiesen werden. Die Blockade der RAF/MEK/ERK-Signalkaskade führte in drei Zelllinien zu einer Reexpression von H-REV107-2. Eine reversible Suppression ist ein typisches Merkmal eines Klasse II Tumor-Suppresspor-Gens. Eine Überexpression des Gens in der Ovarialkarzinom-Zelllinie A27/80 führte zu einer signifikanten Verminderung des Koloniewachstums um mehr als 60%. In der Zelllinie OVCAR-3 hatte H-REV107-2 keinen Einfluss auf das Koloniewachstum. H-REV107-2 ist nicht wie ursprünglich angenommen auf Chromosom 11q23 lokalisiert, sondern auf 11q12, so wie das verwandte Gen H-REV107-1. Beide Gene agieren als negative Wachstumsregulatoren, beide sind teilweise über einen aktiven RAF/MEK/ERK- Signalweg supprimiert, und beide führen nach Überexpression zur Hemmung des Wachstums und zum programmierten Zelltod. MUC18 wurde ursprünglich als Gen identifiziert, welches mit der Invasion und Metastasierung von malignen Melanomen assoziiert ist. Im Mammakarzinom wurde MUC18 jedoch als Tumor- Suppressor beschrieben. Über seine Expression im Ovarialkarzinom war bis zum jetzigen Zeitpunkt sehr wenig bekannt. Die Expressionsanalyse zeigte, dass MUC18 im normalen Ovarialepithel in vitro exprimiert wird. In vier von sieben Ovarialkarzinom-Zelllinien konnte keine und in zwei der drei untersuchten Ovarialkarzinome eine verminderte MUC18 Expression nachgewiesen werden. Eine reversible Suppression des Gens im Ovarialkarzinom konnte durch die Experimente nicht gezeigt werden. Aber die Überexpression von MUC18 in der Ovarialkarzinom-Zelllinie A27/80 führte zu einer signifikanten Hemmung des Koloniewachstums um 44,5%. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass MUC18 im Ovarialkarzinom nicht als Klasse II Tumor-Suppressor-Gen, sondern als Klasse I Tumor-Suppressor-Gen fungiert. Dafür spricht auch die chromosomale Lokalisation auf 11q23.3, einer Region, die in humanen Tumoren häufig verloren geht. Aus publizierten CGH-Analysen der Zelllinien OVCAR-3 und CAOV-3 war ein DNA-Verlust auf 11q21-qter bzw. 11q23-qter bekannt. In beiden Zelllinien konnte aber eine MUC18 Expression nachgewiesen werden. Weiterhin offen bleibt die Frage, warum MUC18 in verschiedenen Tumorzelltypen eine unterschiedliche Wirkung entfaltet. Hierfür sind weitere funktionelle Analysen der durch MUC18 determinierten Regulation des Zytoskelettes notwendig.In our study we investigated the expression of the potential tumor suppressor genes H-REV 107-2/TIG3 und MUC18/MelCAM in human ovarian carcinoma cell lines an ovarian carcinomas. Therefore we performed a nothern blot analysis of 7 ovarian carcinoma cell lines and one ovarian epithelium cell line HOSE. Expression of TIG3 and MUC18 mRNA was detectedin the HOSE cell line. 4 of the 7 ovarian carcinoma cell lines showed no expression of TIG3 or MUC18 mRNA. We treated the ovarian carcinoma cell lines with an inhibitor against activated MEK (PD98059) and investigated TIG3 and MUC18 expression. The same cells were also treated with an inhibitor of PI-3 kinase (LY294002). Increased levels of TIG3 mRNA were observed 48 hr after addition of the MEK-inhibitor PD98059 in CAOV-3, ES-2 and SKOV-3 cells. Modulation of the same pathway did not influence TIG3 expression in MDAH2774, PA-1, OVCAR-3 and A27/80 cells and had also no effect onto MUC18 expression in all 7 carcinoma cell lines. Abrogation of PI-3 kinase signaling by the specific inhibitor LY294002 had no effect onto TIG3 and MUC18 expression. In addition we analyzed a Cancer Profiling Array, a Matched Tumor/Normal Array and an Ovarian Tumor Blot representing cDNA and RNA pairs derived from human tumor tissues and their corresponding normal counterparts of individual patients. In this analysis we detected loss of TIG3 and MUC18 expression in a significant proportion of ovarian carcinomas. We also performed a colony formation assay with A27/80 cells. Ectopic expression of TIG3 in A27/80 cells inhibited the colony formation by more than 60% in comparison to cells transfected with pcDNA3. Ectopic expression of MUC18 in A27/80 cells inhibited the colony formation by more than 40% in comparison to cells transfected with pcDNA3. In conclusion TIG3 is a class II tumor suppressor gene in ovarian carcinomas, whereas MUC18 seems to be a class I tumor suppressor in ovarian carcinomas