Modulation of the Immune response by in vitro and in vivo Manipulation of antigen presenting cells

Titelblatt 1 1\. Abkürzungen 6 2\. Zusammenfassung 8 Summary 10 3\. Einleitung 11 4\. Material und Methoden 31 5\. Ergebnisse 45 6\. Diskussion 83 7\. Literatur 101Die Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung immunologischer Erkrankungen ist das Ziel der heutigen Forschung. Bei einer Vielzahl dieser Krankheiten sind die bei der Differenzierung der T-Helferzellen entstandenen Effektorzelltypen ausschlaggebend für deren Pathogenese. In dieser Arbeit wurde daher versucht mittels DNA Immunisierung auf die Th-Zelldifferenzierung Einfluss zu nehmen und so der Bildung krankheitsfördernder Subpopulationen entgegenzuwirken. Dazu wurde die Immunisierung mit einem Antigen kodierenden Vektor durchgeführt, durch den dieses direkt in den MHC-II-Beladungsweg eingeschleust wird. Somit konnte die Präsentation des Antigens auf transfizierte APCs beschränkt werden. Wir konnten zeigen, dass dies zu einer effizienten Th-Zellaktivierung führt, deren Stärke in vivo mit einer Immunisierung mit sezerniertem Antigen vergleichbar ist. Da das Antigen intrazellulär lokalisiert ist, blieb eine B-Zellaktivierung aus. Es stellte sich jedoch bei der Analyse der Th-Zelldifferenzierung heraus, dass es zu einer verstärkten Th1-Verschiebung mit einem Übergewicht an IFN Produzenten und einer Inhibition der IL-4 Produktion kam. Dabei konnten wir ausschließen, dass diese Th1-Verschiebung auf eine besonders starke Aktivierung der APCs durch in der DNA enthaltene CpG-Motive zurückzuführen war. Auch war die fehlende B-Zellbeteiligung nicht ursächlich für die veränderte Th- Zelldifferenzierung. Eine andere Art der Restriktion der Antigenpräsentation auf transfizierte APCs, mittels einer membrangebundenen Form des Ovalbumins führte nicht zu dieser Th1-Verschiebung, wodurch wir einen direkten Effekt durch die Transfektion der APCs ausschließen konnten. Darüber hinaus beobachteten wir eine verstärkte Induktion von Gedächtniszellen durch die Restriktion der Antigenpräsentation auf transfizierte APCs. Wahrscheinlich ist eine vermehrte Antigenpräsentation über MHC-II-Moleküle, für die verstärkte Generierung von Gedächtniszellen und die ausgeprägte Th1-Antwort verantwortlich. Mit dem Ziel die Th-Zelldifferenzierung in Richtung Th2-Entwicklung zu fördern, wurden Koimmunisierungen mit IL-4 sowie mit siRNA gegen IL-12 durchgeführt. Mit diesen Koimmunisierungen, durch die zusätzliche Th-2-induzierende Faktoren exprimiert wurden, konnte diese starke Th1-Polarisierung jedoch nicht umgekehrt werden. Die oben beschriebene Th1-Verschiebung war offenbar dominant gegenüber diesen Koimmunisierungen. Das gezielte Einschleusen des Antigens in den MHC-II-Beladungsweg ist eine sehr effektive Methode zur Induktion einer starken Immunantwort, mit gleichzeitiger Erhöhung der Th1-Zelldifferenzierung jedoch ohne Antikörperbildung. Diese Immunisierungs-strategie könnte daher ideal zur Behandlung von Th2-dominierten Erkrankungen oder Allergien eingesetzt werden.The development of new therapies to treat immune diseases is one of the aims of current immunological research. In a variety of these diseases the differentiation of T helper cells into different effector cell subpopulations is decisive for the pathogenesis. In the study presented here, DNA immunisation was used to modulate the T-cell differentiation in order to prevent the development of subpopulations involved in the disease. The immunisation was carried out by using a vector encoding for an antigen, which is directly introduced into the MHC class II pathway. This leads to an antigen presentation restricted to directly transfectedAPCs We could show that antigen specific Th cells were efficiently activated in vivo and that the strength of activation was comparable to that of a secreted form of antigen. No B cell activation was observed because of the intracellular localisation of the antigen. Importantly we observed an increased Th1 polarisation characterised by a high number of IFNg producing cells and an inhibition of IL-4 production. We could exclude motifs in the vector DNA to be responsible for an increased activation of APCsleading to the Th1 shift. Furthermore the missing B cell activation was not responsible for the altered Th cell differentiation. Also another type of antigen restriction to transfected APCs using a membrane bound form of Ovalbumin did not lead to this Th1 shift. Thereby we could exclude a direct effect on the APCs by the transfection. Moreover we observed an elevated induction of memory cells by restricting the antigen presentation to transfected APCs . An increased antigen presentation by MHC class II molecules is likely to be the reason for the elevated generation of memory cells and the pronounced Th1 response. Pursuing the aim to promote Th2 cell development co- immunisations were performed using IL-4 and an siRNA against IL-12, respectively. However, neither of these Th2-inducing factors were able to reverse the Th1 polarisation. The aforementioned strong Th1 response was obviously dominating over the co-immunisations. Targeting the antigen to the MHC class II pathway is a very effective method for the induction of a strong immune response, with a concomitant increase of Th1 differentiation but without antibody production. Accordingly this immunisation strategy could be especially suitable for the treatment of Th2 dominated diseases or allergies