Die Mastzell - B-Zell Achse im Gefäßumbau der Lunge und der Pulmonalen Hypertonie

TABLE OF CONTENTS 1\. INTRODUCTION…………………………………………...…………………... 05 1.1 Pulmonary Hypertension……………………………………………………… 05 1.1.1 Definition and Classification…………………………………..........……… 05 1.1.2 Pathology………………………..…………………………..........…………. 06 1.1.3 Pulmonary arterial hypertension…………………………..........………… 07 1.1.4 Pulmonary hypertension due to left heart disease……........…………... 08 1.1.5 Current therapies………………………………………….........…………... 09 1.2 The Immune System……………………………………....………………….. 12 1.2.1 The pulmonary immune defense…………………………........…………. 12 1.2.2 Mast cells…………………………………………………….........……….... 13 1.2.3 B-cells…..……………………………………………….........…………….... 15 1.2.4 Cytokines…..…………………………………………….........………….…. 17 1.2.5 Autoimmunity........................................................................................ 18 1.3 Pulmonary hypertension and inflammation………………………………... 19 2\. AIMS………………………………………………………………………………. 22 3\. MATERIAL AND METHODS……………………………...…………………… 23 3.1 Materials……………………………………………………..………………….. 23 3.1.1 Chemicals, solutions antibodies………………………..........……………. 23 3.1.2 Commercially purchased kits……………..…………..........……………… 23 3.1.3 Animals…………………………………………………...........…………….. 24 3.2 Methods……………………………………………….……………………….... 24 3.2.1 Aortic banding model………………….…………….........………………... 24 3.2.2 Monocrotaline (MCT) model…………………….…….........……………... 25 3.2.3 Sugen-Hypoxia (SuHx) model………………………………….........….… 25 3.2.4 Treatment regimes, ketotifen, anti- CD20 and anti-IL-6……........……... 26 3.2.5 Right ventricular systolic pressure measurements…………….........….. 28 3.2.6 Histology sample preparation and vascular remodeling…….........……. 29 3.2.7 Toluidine blue staining…………………………………………..........…….. 29 3.2.8 Immune fluorescence…………………………………………..........……... 29 3.2.9 ELISA……………………………………………………………..........…….. 30 3.2.10 Flow Cytometry……...………………………………………........……….. 30 3.2.11 Microarray analysis……………………………………….......………….... 31 3.2.12 Data analysis……………………………………………….......…………... 31 4\. RESULTS………………………………………………………..…………..…… 32 4.1 Differentially regulated mast cell dependent genes……….…………….… 32 4.2 Aortic banding time course analysis……………………………………….... 34 4.3 B-cells accumulate locally and systemically………………..…………….… 36 4.4 Mast cells secrete IL-6…………………………………………….………….. 39 4.5 Effect of IL-6 depletion on mast cell and B-cell accumulation….………... 40 4.6 A functional role for IL-6………………………………………………………. 42 4.7 A functional role for B-cells…………………………………………………... 43 4.8 Autoantibodies in PH………………………………………………………….. 47 5\. DISCUSSION…………………………………………………………………….. 49 5.1 Mast cells interact with B-cells in PH……………………………….………... 49 5.2 IL-6 drives mast cell – B-cell interaction in PH……………………..………. 53 5.3 A functional role for B-cells and a case for autoimmunity…………...……. 55 5.4 Concluding remarks……………………………………………………………. 57 6\. SUMMARY……………………………………………………………………….. 59 7\. ZUSAMMENFASSUNG………………………………………………………… 61 8\. PUBLICATIONS AND AWARDS…………………………………………….… 63 8.1 Publications in peer reviewed journal…………………………….………….. 63 8.2 Presentations at international conferences………………………..……….. 64 8.3 Awards and scholarships……………………………………………………… 64 9\. LIST OF ABREVIATIONS……………………………………………………… 65 10\. STATUTORY DECLARATION……………………………………....……….. 67 11\. BIBLIOGRAPHY……………………………………………………………….. 68Pulmonary Hypertension (PH) is a progressive cardiovascular disease, characterized by an increase in mean pulmonary arterial pressure concomitant with severe pulmonary vascular remodeling and obliteration of small and medium sized arteries and endothelial dysfunction, ultimately leading to death by right heart failure. Although a contribution of the immune system to the pathogenesis of PH has been discussed for several decades, the role of autoimmunity in PH and its underlying mechanisms are still poorly understood. Previously, pulmonary infiltration of mast cells in PH has been reported by several groups, including our own. Furthermore, our group could demonstrate the functional relevance of mast cells in lung vascular remodeling and PH. Based on these results we performed a gene array analysis and probed for mast cell dependent genes which are differentially regulated in experimental PH. Surprisingly, the only mast cell dependent genes significantly regulated were genes encoding for constituents of immunoglobulins. In subsequent experiments we were indeed able to detect an increase in pulmonary IgG and B-cell levels in the aortic banding model of PH due to left heart disease as well as in the monocrotaline and the sugen-hypoxia model of pulmonary arterial hypertension. IL-6 is a potential candidate to link mast cells and B-cells in PH, based on its well-known pathogenic role in PH and based on previous reports showing mast cells to secrete IL-6, and IL-6 to stimulate B-cells. In our experiments we detected a high degree of co-localization between mast cells and IL-6, thus identifying mast cells as primary source of IL-6 in experimental PH. Furthermore, we could show a connection between IL-6 depletion and B-cell accumulation, to the effect that IL-6 depletion reduced the area size of tertiary lymphoid tissue, as observed in immunofluorescence. A functional role for B-cells in the disease process was demonstrated by use of both B-cell deficient JH-KO rats and by depleting B-cells using an anti-CD20 antibody. Both approaches significantly attenuated vascular remodeling and PH. Lastly our data indicate the presence of autoantibodies in PH, and are thus hinting towards a potential autoimmune disease mechanism. Overall our data yield novel insights into the role of the immune system in PH, in that they provide evidence for a mast cell – B-cell axis which is driven by IL-6. Provided our findings can be confirmed in human samples, they could be rapidly translated into the clinical scenario by implementation of targeted immune therapy with drugs already on the market such as Rituximab (anti-CD20 antibody), or Tocilizumab (anti-IL-6 receptor antibody).Die Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine stetig fortschreitende kardiovaskuläre Erkrankung die durch einen Anstieg des mittleren pulmonalarteriellen Drucks, einhergehend mit pulmonalem Gefäßumbau und Obliteration der kleinen und mittleren Arterien und endothelialer Dysfunktion, charakterisiert ist, und schlussendlich zum Tod durch Rechtsherzversagen führt. Obgleich eine Beteiligung des Immunsystems an der Entstehung der PH bereits seit mehreren Jahrzehnten diskutiert wird, sind die Rolle der Autoimmunität und die ihr zugrundeliegenden Mechanismen bislang nur unzureichend verstanden. Die Infiltration von Mastzellen in die Lunge bei PH wurde bereits früher von mehreren Gruppen beschrieben, darunter auch der unsrigen. Darüber hinaus konnten wir in vorangegangenen Untersuchungen bereits eine allgemeine funktionelle Beteiligung der Mastzellen am vaskulären Gefäßumbau und der PH nachweisen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir nun in der vorliegenden Arbeit Gene-Array-Analysen durchgeführt, um Gene zu identifizieren, welche Mastzell-abhängig in der PH reguliert werden. Bemerkenswerterweise waren die einzigen Mastzell-abhängigen Gene, welche signifikant reguliert wurden, Gene, die für Bestandteile von Immunglobulinen kodieren. Tatsächlich zeigten unsere nachfolgenden Experimente einen Anstieg an pulmonalen IgGs und B-Zellen sowohl im Aortenbandingmodell der PH infolge von Linksherzversagens, als auch im Monocrotaline und im Sugen-Hypoxiemodell der pulmonalarteriellen Hypertonie. IL-6 ist ein vielversprechender Kandidat, um als Bindeglied zwischen Mastzellen und B-Zellen in der PH zu fungieren. Dies leitet sich aus der gut dokumentierten pathogenen Rolle von IL-6 in der PH sowie aus Studien ab, welche zeigen konnten, dass Mastzellen IL-6 sezernieren und dass IL-6 B-Zellen zur Proliferation und Aktivierung zu stimulieren vermag. In unseren Untersuchungen konnten wir eine ausgeprägte Co- Lokalisation von Mastzellen und IL-6 nachweisen, und damit Mastzellen als die primäre Quelle von IL-6 in der PH identifizieren. Weiterhin konnten wir eine Verbindung zwischen der Depletion von IL-6 und der verminderten Akkumulation von B-Zellen nachweisen, dahingehend, dass nach Depletion von IL-6 eine Reduktion in der Fläche des tertiär lymphoiden Gewebes beobachtet werden konnte. Eine funktionelle Rolle von B-Zellen im Krankheitsverlauf konnten wir schließlich entweder durch Verwendung B-Zell defizienter JH-KO Ratten oder durch Depletion von B-Zellen mittels eines anti-CD20 Antikörpers demonstrieren insofern als beide Methoden den vaskulären Gefäßumbau und die PH signifikant zu vermindern vermochten. Schließlich weisen unsere Befunde auf das Vorhandensein von Autoantikörpern in der PH hin, und zeigen so einen potentiellen Mechanismus der Autoimmunität auf. Insgesamt vermitteln unsere Daten neue Einblicke in die Rolle des Immunsystems in der PH und liefern Hinweise auf eine Mastzell – B-Zell Achse, die durch IL-6 vermittelt wird. Vorausgesetzt unsere Daten können in humanen Proben bestätigt werden, wäre eine zügige Übertragung der Ergebnisse in den klinischen Alltag durchaus realistisch, zumal entsprechend immunmodulatorische Medikamente wie z.B. Rituximab (anti-CD20 Antikörper) oder Tocilizumab (anti-IL-6 Rezeptor Antikörper) bereits heute zugelassen sind, und entsprechend umgehend zur gezielten Immuntherapie bei PH eingesetzt werden könnten