Strukturelle und Funktionelle Analyse von LTBP 4 als Faktor der Pathogenese des Lungenemphsems

Table of contents 4 List of tables and figures 9 Abbrevations 12 1\. Introduction 17 1.1. Lung organogenesis 17 1.1.1. Early lung development 19 1.1.2. Late lung development 20 1.2. Key factors of lung development 21 1.2.1. Cell differentation and ECM deposition during lung development 22 1.2.1.1. Myofibroblasts 23 1.2.1.2. Myofibroblast transdifferentation 25 1.2.1.3. Myofibroblasts in alveolarisaton 26 1.3. Biochemical regulation of lung development 29 1.3.1. TGFβ in mammalian lung tissue 30 1.3.2. TGFβ signalling 32 1.2.2. TGFβ signalling in lung development 33 1.4. Latent TGFβ Binding Protein (LTBP) 35 1.4.1. Regulation oft he bioavailability of TGFβ Through LTBPs 35 1.4.2. Structure of LTBPs 37 1.5. Diseases associated with LTBP4 41 Ltbp4s knockout mice (3C7) 41 Ltbp4 -/- mice (E301B04) 42 Urban Rifkin Davis syndrome (URDS) 43 1.6. Outline of the thesis 47 2\. Material and Methods 49 2.1. Materials 49 2.1.1. Standard solutions 49 2.1.3. Antibodies 53 2.1.4. Primers for qRT-PCR 54 2.1.5. siRNA 56 2.2. Methods 57 2.2.1.. Animal work 57 2.2.1.1. Trunc blood analyses 57 2.2.1.2. Tissue processing 58 2.2.1.3. Histology 59 H&E; staining of lung sections 59 Histomorphometric analysis of lung sect. 60 Ltbp4 staining of lung sections 61 Hart staining of lung sections 62 Anti sma staining of lung sections 62 2.2.2. Cell culture 63 2.2.2.1. Human embryonic lung fibroblasts (HEL) 63 Transfection of HEL 64 2.2.2.2. Isolation of primary murine lung fib. 65 Immunocytochemistry 66 Stimulation of primary murine lung fibroblasts with TGFβ 67 2.2.2.3. Relaxed collagen lattices 67 PCNA staining of relaxed collagen lattices 68 2.2.2.4. Stressed collagen lattices 69 SMA staining of stressed collagen lattices 70 2.2.3. Molecular biological methods 71 2.2.3.1. RNA extraction and qRT-PCR 71 2.2.4. Protein biochemical methods 72 2.2.4.1. Western Blot analyses 72 2.2.4.2. TGF β activity assay 73 2.2.5. Statistical analyses 74 3\. Results 76 Ltbp4 -/-mice develop severe hypercapnia and Polycytemia 76 Lack of Ltbp4 impairs postnatal alveolarisation in Ltbp4 -/-mice 78 Impaired myofibroblast trans-differentation in lung tissue of Ltbp4 -/-mice 81 Disruption of elastic fibres in lung tissue of Ltbp4 -/-mice 85 Characterisation of underlying molecular mechanisms of myofibroblast transdifferentiation in Ltbp4-/-mice 87 Impaired ability of matrix organisation of LTBP4-/-fibroblasts 87 Ctgf and Pai-1 are negatively regulated in primary murine Ltbp4-/- lung fibroblasts 94 Tgfβ1 activity is altered in primary murine Ltbp4-/-lung fibroblasts 97 Downregulation of Ctgf and Pai-1 is reversible in primary murine Ltbp-4-/- lung fibroblasts 99 4\. Discussion 102 5\. Zusammenfassung 117 6\. Summary 121 7\. References 124 8\. Acknowledgements 137 9\. Erklärung 141The American Journal of Human Genetics published in 2009 four cases of newborn children with a complex disease pattern, the Urban-Rifkin-Davis Syndrome (URDS). All patients had mutations of the Latent TGF¬β binding Protein 4 (LTBP¬4) gene. LTBP¬4 is one of four known LTB proteins. Eponymous for this protein family is the strong interaction with Transforming growth factor β (TGF¬β). In addition LTBP¬4 it is assumed as a distinct structural protein of the ECM. Disruption of LTBP¬4 leads to a variety of disease patterns. Preceding studies have shown that mice lacking the short variant of Ltbp¬4 (Ltbp4s) develop a complex phenotype with cardiomyopathy, colorectal cancer and pulmonary emphysema. Human patients suffering URDS exhibit impaired pulmonary, gastrointestinal, genitourinary, musculoskeletal and dermal development. Despite a huge variety of disease patterns all individuals with mutations in the LTBP¬4 gene share one phenotype; the development of pulmonary emphysema at the stage of postnatal alveolarisation. Aim of this study was the structural and functional analysis of LTBP¬4 as a factor of pathogenesis in the development of pulmonary emphysema. To avoid any splicevariant specific effects, Ltbp4 complete knockout mice (Ltbp4-/-) were analysed via assessment of oxygenation and lung structure. In vitro investigations on myofibroblast transdifferentation, matrix structuration and TGFβ activation were performed on primary murine Ltbp4-/- lung fibroblasts as well as siRNA transfected, LTBP4 deficient human lung fibroblasts. Ltbp4-/- mice die within the first ten days of life with severe hypercapnia and polycythemia. Lung tissue of Ltbp4-/- mice exhibit impaired alveolarisation, disrupted alveolar elastic fibre distribution and reduced myofibroblast transdifferentation. Both primary Ltbp4-/- lung fibroblasts as well as siRNA transfected, LTBP4 deficient human lung fibroblasts revealed impaired matrix structuration in vitro. In summary two key processes of postnatal alveolarisation: myofibroblast transdifferentation and alveolar elastic fibre formation are disrupted in Ltbp4-/- mice, thereby implicating the pivotal role of LTBP4 during alveolarisation. This is the first study investigating the impact of Ltbp¬4 on postnatal alveolarisation by means of a new animal model, the Ltbp4-/- model.Im Jahr 2009 veröffentlichte die Arbeitsgruppe um Davis erstmals vier Fälle von humanen Patienten welche ein komplexes Krankheitsbild zeigten, das Urban- Rifkin-Davis Syndrom (URDS) (Urban, Hucthagowder et al. 2009). Alle beschriebenen Fälle hatten Mutationen im Latent Transforming growth factor β (TGF¬β) bindenden Protein 4 (LTBP¬4). LTBP¬4 ist eines von vier Latent TGF-β bindenden Proteinen (LTBP¬1-4). Namensgebend für die Familie der LTBP Moleküle ist die enge Interaktion mit (TGF¬β). Neben der Beteiligung von LTBP¬4 im TGF-β1 Signalweg gibt es jedoch Hinweise, dass LTBP¬4 zusätzlich eine Funktion als Strukturprotein der extrazellulären Matrix (ECM) erfüllt. Mutationen des LTBP¬4 Genes resultieren in einer Vielzahl von Erkrankungen. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass Knockoutmäuse denen die kurze Variante des Ltbp¬4 (Ltbp¬4s) fehlt ein komplexes Krankheitsbild mit unter anderem Störungen des Herz-Kreislaufsystems und des Atmungstraktes ausbilden. URDS Patienten zeigen Veränderungen im Gastrointestinaltrakt, Urogenitaltrakt, der Haut und der Lunge. Allen Individuen mit Mutationen im LTBP¬4 Gen ist dabei die Entwicklung von Lungenemphysemen im Stadium der postnatalen Alveolarisation gemeinsam. Um durch Splicevarianten verursachte Effekte auszuschließen, wurden in dieser Studie erstmals bis dato noch nicht beschriebene Ltbp4 komplett Knockout - Mäuse (Ltbp¬4-/- Mäuse) untersucht. Ziel war die Analyse der Rolle von LTBP¬4 als Faktor in der Pathogenese von Lungenemphysemen. Ltbp¬4-/- Mäuse wurden mittels Blutgasanalysen und Lungenhistologischen Untersuchungen charakterisiert. Sowohl primäre murine Ltbp¬4-/- Lungenfibroblasten, als auch siRNA transfizierte LTBP4 defiziente humane Lungenfibroblasten wurden im Hinblick auf Myofibroblastentransdifferenzierung, Matrixstrukturierung und TGFβ Aktivität untersucht. Ltbp¬4-/- Mäuse versterben innerhalb der ersten zehn Lebenstage nach schwerer Hyperkapnie und Polyzytämie. Das Lungengewebe zeigt eine verminderte Alveolarisation, fragmentierte elastische Fasern in den Alveolen und reduzierte myofibroblasten Transdifferenzierung. In vitro zeigten die LTBP4 defizienten humanen und murinen Lungenfibroblasten eine gestörte Strukturierung der extrazellulären Matrix. Zusammengefasst sind sowohl die Myofibroblastendifferenzierung als auch weitere Schlüsselmechanismen der postnatalen Alveolarisation, wie die Bildung von alveolären elastischen Fasern bei Ltbp¬4-/- Mäusen gestört. Diese Studie ist die erste, die eine gestörte postnatale Alveolarisation im Zusammenhang mit Mutationen im LTBP¬4 Gen untersucht und gibt neue Einblicke in die Funktion von LTBP-4 als Faktor in der Lungenentwicklung