Identification and functional characterisation of transferrin receptor shedding proteases

0\. Titel und Inhaltsverzeichnis 1\. Zusammenfassung / Summary 1 2\. Einleitung 5 3\. Ergebnisse 20 4\. Diskussion 46 5\. Material 60 6\. Methoden 65 7\. Glossar 76 8\. Literaturverzeichnis 77 9\. Anhang 95Der Transferrinrezeptor (TfR) vermittelt die Aufnahme von Eisenionen in das Zellinnere. Die transferrinbindende Domäne des TfR kann im Bereich eines molekularen Abstandshalters (Stalk) zwischen Arg-100 / Leu-101 durch eine Protease von der Membran abgespalten und als so genannter löslicher (soluble) Transferrinrezeptor (sTfR101) freigesetzt werden. Obgleich die Serumkonzentration dieses sTfR101 bei bestimmten Erkrankungen verändert sein kann und als diagnostischer Parameter Verwendung findet, sind die molekularen Grundlagen dieses Prozesses noch weitestgehend unverstanden - insbesondere ist die Identität der beteiligten Sheddingprotease(n) unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei Serinproteasen den humanen TfR spezifisch an alternativen Schnittstellen im Stalk-Bereich schneiden: Neutrophile Elastase zwischen Val-108 / Arg-109 und Cathepsin G zwischen Lys-95 / Thr-96. Im Überstand von U937-Zellen wurden zudem zwei sTfR- Formen detektiert, die sich aufgrund ihrer molekularen Masse alternativen Formen des sTfR zuordnen lassen. Aus dem Kulturüberstand der leukozytären Zelllinie HL60 wurde dagegen ein sTfR isoliert, dessen N-Terminus mit Leu-101 beginnt. Die Freisetzung des sTfR101 aus isolierten Membranen wurde genutzt, um die bei Arg-100 spaltende TfR-Sheddingprotease erstmals näher zu charakterisieren: (i) Sie ist ein integrales Membranprotein. (ii) Der Sheddingprozess ist abhängig von einer intakten Membranstruktur. (iii) Sie ist inaktiv im sauren pH-Bereich und besitzt ein Optimum bei pH 7,5. (iv) Sie wird vermutlich durch Furin oder eine furinähnliche Protease aktiviert. (v) Sie zählt zu der Klasse der Metalloproteasen, vermutlich aus der Familie der ADAMs (a disintegrin and metalloprotease). (vi) TACE / ADAM-17 kann als TfR- Sheddingprotease ausgeschlossen werden, da die Protease durch TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases), aber nicht TIMP-2 oder TIMP-3 inhibiert wurde. Zur Untersuchung des TfR-Sheddings im Zellsystem wurde ein ELISA optimiert, mit dessen Hilfe sTfR spezifisch im Kulturüberstand von leukozytären Zelllinien detektiert und quantifiziert wurde. Diese Ergebnisse bestätigten die Inhibitionsversuche, die mit Hilfe des Membranassays durchgeführt wurden. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass der Freisetzungsprozess des sTfR101 in den Zellen konstitutiv abläuft, und als einziges, eindeutig das TfR-Shedding stimulierende Reagenz wurde der Tyrosinphosphataseinhibitor Pervanadat ermittelt. Biotinylierungsexperimente an leukozytären Zelllinien zeigten, dass der TfR zunächst auf der Zelloberfläche erscheinen muss, bevor er dem Sheddingprozess unterliegt - folglich nicht bereits auf dem Biosyntheseweg gespalten wird. Da PMA keinen reduzierenden Einfluss auf das Shedding der Zelllinien zeigte, kann die Plasmamembran der Zellen als Ort des Sheddings vermutlich ausgeschlossen werden. Auch der endosomale Recyclingweg erscheint aus den Ergebnissen dieser Arbeit unwahrscheinlich, da die TfR-Sheddingprotease nicht im sauren pH- Bereich aktiv ist.The transferrin receptor (TfR) mediates the cellular uptake of iron. The transferrin-binding extracellular domain of the receptor is cleaved in the stalk region between Arg-100 / Leu-101 by a protease and released as soluble TfR (sTfR101). Although the serum concentration of sTfR101 is altered in certain diseases and used as diagnostic parameter, the molecular basis of this process is largely unknown - in particular the identity of the protease involved is unknown. In the present work two proteases, which specifically cleave the human TfR in the stalk region were identified: neutrophil elastase between Val-108 / Arg-109 and cathepsin G between Lys-95 / Thr-96. These cleavage sites are in the near vicinity of the major cleavage site and have not been previously described. The assumption that alternative cleavage sites are present in vivo is supported by the observation in this work that two sTfR types occur in the supernatant of U937 cells. These sTfR types were classified as alternative sTfR because of their apparent molecular mass. In contrast the N-terminus of the sTfR isolated from HL60 cell culture supernatant was shown to start with Leu-101. After incubation of the membranes at 37 °C the sTfR101 was shed and used to establish an assay which would allow the involved protease to be characterised: (i) the protease is anchored to the membrane by an integral domain, (ii) TfR-shedding depends on an intact membrane structure, (iii) the protease is inactive at acidic pH with an optimum at pH 7.5, (iv) the protease is probably activated by furin or a furin-like pro-protein convertase, (v) the protease belongs to the metalloproteases, probably the ADAM-family (a disintegrin and metalloprotease) and (vi) TACE / ADAM-17 can be excluded, since the protease is inhibited by TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases-1) but not TIMP-2 or TIMP-3. The TfR-shedding by leukocytic cell lines was determined in a specific ELISA optimised for quantifying sTfR in cell culture supernatant. The investigations revealed that the results of the inhibition experiments obtained by means of the membrane assay are in agreement with the cell system. Furthermore it was shown that the TfR-shedding process is mediated constitutively and the only reagent tested that stimulates TfR-shedding is the tyrosine phosphatase inhibitor pervandate. Since the localisation of TfR-shedding is unresolved, biotinylation experiments with leukocytic cell lines were performed. These experiments clearly show that the TfR must appear at the cell surface before it is shed - thus it is not cleaved during the biosynthetic pathway. The induced internalisation of the TfR by the phorbol ester PMA did not reduce TfR-shedding in the cell lines, the plasma- membrane can thus be excluded as the site of the TfR-shedding event. Furthermore the endosomal recycling pathway may also be excluded since the TfR-shedding protease is not active at acidic pH