Analyse des Atems ermöglicht nicht-invasive Identifikation und Quantifizierung von Erkrankungen und metabolischer Dysfunktion

Subjects Page No. 1\. Introduction 1-7 1.1. Volatile Organic Compounds (VOCs) ……………………………………….. 1 1.2. Breath Gas Analysis (BGA) ………………………………………………….. 4 1.3. The Principle of The BGA …………………………………………………… 5 1.4. Common VOCs Apparatuses ………………………………………………… 7 2\. Medical Background 8-13 2.1. CO2 Production Rate Measurement ….………………………………………. 8 2.2. Bicarbonate Kinetics Model ………………………………………………….. 9 2.3. Stable Carbon-13 Isotope Breath Test ..………………………………………. 12 3\. 13C-Methacetin for Monitoring the Liver Function 14-35 3.1. The Physiology of the Liver ………………………………………………….. 14 3.2. Liver Function Breath Tests ………………………………………………….. 17 3.3. 13C-Methacetin Breath Analysis ........................................................................ 17 3.4. Bicarbonate Kinetics of 13C-Methacetin ……………………………………... 19 3.5. The DOB- Kinetics …..………………………………………………………... 20 3.6. The LiMAx-Test ……………………………………………………………… 22 3.7. The Principle of FANci2 ................................................................................... 23 3.8. The Principle of FLIP ........................................................................................ 24 3.9. The Influence of O2 on the DOB Value ............................................................ 24 3.10. The Influence of Dosage and Sports on DOB-Kinetics and LiMAx-Test ..… 25 4\. Materials and Experimental Work 36-46 4.1. Breath Gas Sampling …………………………………………………………. 36 4.2. Tedlar Bag and Teflon Tube …………………………………………………. 36 4.3. Effect of Tedlar Bag on VOCs …..…………………………………………… 37 4.4. Identification of the VOCs …………………………………………………… 38 4.4.1. Proton- Transfer Reaction Mass Spectrometry (PTR-MS) …...................... 38 4.4.1.1. The Principle of PTR-MS Measurement ............................................... 39 4.4.1.2. Measurement with PTR-MS .................................................................. 41 i. Vegan (People with Special Nutrition) …………………………………… 41 ii. Volunteers (Reference) …………………………………………………... 42 iii. Patients with Liver Diseases …………………………………………….. 42 4.4.2. Ion Mobility Spectrometry (IMS) ............................................................... 43 4.4.2.1. The Principle of IMS Measurement ...................................................... 44 4.4.2.2. Measurement with IMS ......................................................................... 46 5\. Results and Discussion of PTR-MS 47-107 5.1. PTR-MS Spectrum …….…………….………………………………………. 47 5.2. Ion Counts Determination ……………………………………………………. 48 5.3. Ion Counts Normalization …………...…………………………………….…. 49 5.4. Paradigmatic Test Compounds ………………………...…………….……….. 50 5.4.1. Isoprene Model ………………………………………..………………….. 51 5.4.2. Acetone Model …………………………………………………………… 51 5.4.3. Separating Overlapping Signals …………………..……………………… 53 5.5. Determination of Pearson’s Correlation Coefficient (r) ……………………… 55 5.6. VOCs Assessment …………………………………….……………………… 57 5.7. Influence of Tedlar Bags on VOCs Concentrations ……………………………. 58 5.8. Volatile Organic Compounds (VOCs) as Biomarkers …………………………. 60 5.8.1. VOCs as Liver Diseases Biomarkers ......................................................... 60 5.8.1.1. Organosulfur Compounds …….……………………………………… 61 5.8.1.2. Volatile Fatty Acid Compounds ……………………………………… 69 5.8.1.3. Nitrogen Containing Organic Compounds …………………………… 72 5.8.1.4. Nitrile Compounds …………………………………………………… 80 5.8.1.5. Hydrocarbon Compounds ………..…………………………………… 82 5.8.1.6. Aldehyde and Ketone Compounds …………………………………… 97 5.8.1.7. Alcohol Compounds ………………………………………………….. 102 5.8.1.8. Terpene and Terpenoid Compounds …………………………………. 105 5.8.1.9. Organoselenium Compounds ………………………………………… 106 Summary and Outlook 108-111 List of Publications 112 Appendices 113-216 Part 1: Tables 113-185 Table 1: The data information that belong to Vegans according to PTR-MS measurement. 113 Table 2: The data information that belong to Volunteers according to PTR-MS measurement. 114 Table 3: The data information that belong to patients with liver diseases according to PTR-MS measurement 115-116 Table 4: The DOB and LiMAx values according to the type of liver disease for FANci and FLIP. 117-118 Table 5: The data information that belong to volunteers according to IMS measurement. 119 Table 6: Tentative assignments of some compounds at each protonated mass (m/z). 120-183 Table 7: The Organosulfur compounds. 184-185 Part 2: 186-189 5.7.1. Linear Time Dependence ……………………………………………... 186 5.7.1.1. Constant Linear Time Dependence ................................................... 186 5.7.1.2. Increasing Linear Time Dependence ................................................. 186 5.7.1.3. Decreasing Linear Time Dependence ............................................... 187 5.7.2. Nonlinear Time Dependence ……..…..................................................... 188 5.7.2.1. Rising Kinetics …….……………..................................................... 188 5.7.2.2. Decaying Kinetics ………………..................................................... 188 Part 3: 190-191 5.8.2. Other VOCs Biomarkers …………………………………………………. 190 5.8.2.1. Methyl group-CH3 ……………………………………………………. 190 5.8.2.2. The Water and Water Multimere Peak Identification ………………... 190 Part 4: Results and Discussion of IMS 192-216 6.1. VisualNow Window .......................................................................................... 192 6.2. Data from MCC-IMS ........................................................................................ 194 6.3. The Pre-requisites for Sample Analysis ............................................................ 195 6.4. The Comparability of the Measurements .......................................................... 196 6.5. Comparisons within Spectra and Chromatograms ………………….……….. 198 6.6. Peak Detection and Comparison ....................................................................... 199 6.7. Factors Effecting on the VOCs Intensity ......................................................... 200 6.7.1. Comparative Study between Different Statuses of Diet ............................ 200 i. Before Eating (Fasting From the Day Before) ................................................ 201 ii. After Eating .................................................................................................... 202 iii. After Washing the Mouth with Listerine Mouthwash .................................. 202 iv. After Washing the Mouth with Tap Water and Drinking Tap Water Many Time ............................................................................................................... 203 v. After Chewing Peppermint Gum .................................................................... 204 6.7.2. Comparative Study between Direct Breath and Indirect Breath ………… 206 6.7.3. Comparative Study between Smoker and non-Smoker .............................. 208 6.8. Influence of Tedlar Bags on VOCs concentrations ………………………….. 211 6.8.1. Linear Time Dependence ............................................................................ 213 6.8.1.1. Constant Linear Time Dependence ....................................................... 213 6.8.1.2. Increasing Linear Time Dependence ..................................................... 213 6.8.1.3. Decreasing Linear Time Dependence ................................................... 214 6.8.2. Nonlinear Time Dependence ....................................................................... 215 6.8.2.1. Rising Kinetics ………………….......................................................... 215 6.8.2.2. Decaying Kinetics ………………......................................................... 215 Bibliography Acknowledgement Curriculum Vitae Erklärung der SelbstständigkeitIn the last decade breath gas analysis (BGA) became more and more important in industry and sciences. This trend is caused by the development of new and stable semiconductor lasers, e.g. quantum cascade lasers, in the mid-infrared region ranging from 3 µm to 15 µm. Moreover, specific mass spectrometers were developed for detection of volatile organic compounds (VOCs) in a volume sensitivity range of parts per trillion. Companies like Ionicon and B&S; Analytic GmbH specialized on detection of VOCs in breath, food and exhaust air. A new measurement device FLIP (Fast Liver Investigation Packet) based on breath gas analysis of CO2 was developed in the AG Heyne to assess the liver power or liver function capacity of humans. This device together with the LiMAx-test (Liver Maximal capacity) developed by Priv.-Doz. Martin Stockmann (Charité-Universitätsmedizin) enables a personalized and quantitative determination of the liver function capacity by detecting the increase of 13CO2 in the exhaled air after 13C-methacetin administration. Functionally, 13C-methacetin is metabolized in all hepatic cells by the enzyme Cytochrome P450 1A2 to paracetamol and 13CO2. Thus, the speed of metabolism measured by the 13CO2 to 12CO2 ratio in the breath is directly proportional to the liver function capacity. No other test can provide this information. The value measured is called the LiMAx value and calculated from the maximum of the 13CO2 to 12CO2 ratio. However, the kinetics of this ratio during 60 minutes also contains information for the physicians treating the liver disease. The combination of FLIP device and LiMAx-test is already in clinical use. My work is divided into two parts. After a general introduction, in the first part, I analyzed data taken at the Charité to investigate the influence of dosage and sports on the outcome of the LiMAx-test. Furthermore, I compare the reproducibility of the breath test measurements with blood levels of paracetamol and methacetin. I will show that the 13CO2 detection enables a direct tracking of methacetin metabolization in the liver cells. In the second part of my work, I studied the occurrence of VOCs in the exhaled air with mass spectrometry. The sensitivity and speed of analysis of these detection devices have increased greatly in the last decade. The knowledge on metabolic processes in the human body has a lot of advantages in early diagnosis of diseases and metabolic malfunctions. Since non-invasive breath tests experiences a high acceptance from patients, an assessment of the possible uses of breath gas analysis is of high importance. Diagnosing a disease with BGA is a safe, non-invasive and fast technique. The breath gas contains both non-volatile (e.g. CO2) and volatile substances. The observation of volatile substances in human breath (e.g. acetone) has been made by medical professionals for a long time (Hippocrates). The detection of bad smell/odor in the breath was used to identify specific diseases. Each VOC can be considered as a partial indicator for a specific metabolization or disease such as respiratory disease, liver disease and etc. In my study, two different spectrometry methods, the Proton Transfer Reaction Mass Spectrometry (PTR-MS) and Ion Mass Spectrometry (IMS) were used to study the occurrence of VOCs in breath and to investigate the effect of different health statuses on the production of VOCs. Since, these methods were new in the AG Heyne, we started with measurements to verify the reproducibility of the measurements and the independence of other parameters, such as how we collected the breath. Here, we studied the behaviour of the VOCs concentrations in time by collecting breath samples from volunteers and analysing them over one week. This part of study was performed with the PTR-MS and the IMS device. With PTR-MS, two types of studies were done: The first study is considered as a comparative study between three different types of groups, who had different health statuses. We investigated a group of vegans (denoted as super healthy), a group of healthy volunteers and patients with liver diseases in cooperation with the Charité. Each VOC has a specific signature that is affected by the health status, so it increases or decreases more in one case than in others. In the second study we investigated the LiMAx-value of the patients to correlate the VOC concentration with the liver status. Another study was done using the IMS to identify factors that have an influence on the VOCs intensities such as the effect of diet statuses, the differences between direct and indirect breath and smoking. Since we found that the reproducibility of the IMS measurements are not reliable enough, and the identification of VOC peaks is largely missing, these results are presented in the appendix of this work.Im letzten Jahrzehnt ist die Atemgasanalyse immer wichtiger für die Industrie und die Wissenschaften geworden. Dieser Vorgang wird durch die Entwicklung von neuen und stabilen Halbleiterlaser im mittleren Infrarot von 3 μm bis 15 μm getrieben. Zusätzlich werden Massenspektrometer zum Nachweis von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) mit einer Empfindlichkeit (bezüglich des Volumens) von einigen Billionstel entwickelt. Firmen wie Ionicon und B&S; Analytic GmbH spezializieren sich auf den Nachweis von VOCs im Atem, in der Nahrung und in Abgasen. Ein neues Meßgerät FLIP (Fast Liver Investigation Packet), basierend auf der Analyse des CO2 in der Atemluft, wurde von der AG Heyne entwickelt, um die Leberleistung und die Leberfunktionskapazitäten beim Menschen zu bewerten. Dieses Gerät unter Hinzunahme des LiMAx-tests (Liver MAximal capacity) von Priv.-Doz. Martin Stockmann (Charité - Universitätsmedizin) entwickelt, erlaubt ein personalizierte und quantitative Bestimmung der Leberfunktionskapazität durch Messung des erhöhten 13CO2 in der ausgeatmeten Luft nach 13C-Methacetin IV-Injektion. Von der Funktion her wird 13C-Methacetin in allen hepatischen Zellen durch des Enzym P450 1A2 zu Paracetamol und 13CO2 metabolisiert. Das heißt, die Schnelligkeit des Metabolismus gemessen durch das 13CO2 zu 12CO2 Verhältnis im Atem ist direkt proportional zu der Leberfunktionskapazität. Kein anderes Prüfverfahren kann diese Information liefern. Der gemessene Wert wird LiMAx-Wert genannt und errechnet sich aus dem Maximum des 13CO2 zu 12CO2 Verhältnisses. Jedoch liefert die Kinetik dieses Verhältnisses in der sechzig minutigen Meßzeit auch Informationen für den die Leberkrankheit behandelden Arztes. Die Verbindung vom FLIP-Gerät und LiMAx-Tests wird schon in Kliniken verwendet. Meine Arbeit kann in zwei Hauptteile geteilt werden. Nach einer allgemeinen Einleitung, untersuchte ich im ersten Hauptteil Daten, welche an der Charité erhoben wurden, um den Einfluß der Dosierung und Sport auf des Ergebnis der LiMAx- tests zu untersuchen. Weiterhin verglich ich die Reproduzierbenkeit des Atem- Tests mit den Blutwerten für Paracetamol und Methacetin. Ich werde zeigen, daß der 13CO2 Nachweis ein direktes Verfolgen des Methacetin-Metabolismus in Leberzellen erlaubt. Im zweiten Hauptteil meiner Arbeit untersuchte ich des Vorkommen von VOCs in der Atemluft mit Massenspektroskopie. Die Empfindlichkeit und Schnelligkeit der Analyse dieser Geräte sind im letzten Jahrzehnt sehr gestiegen. Das Wissen um metabolische Prozesse des menschlichen Körpers ist von Vorteil für die Frühdiagnose von Krankheit und metabolischen Fehlfunktionen. Da nicht-invasive Atemuntersuchungen von Patienten gut akzeptiert werden, ist eine Bewertung möglicher Anwendurgen von Atemuntersuchungen sehr wichtig. Die Diagnose einer Krankheit mit BGA ist sicher, nicht-invasiv und schnell. Die Atemluft enthält sowohl „nicht- flüchtige“ (z.B. CO2) wie auch flüchtige (leicht verdampfbare) Stoffe. Die Feststellung von flüchtigen Stoffen in der menschlichen Atemluft (z.B. Aceton) ist von Medizinern seit langem (Hippokrates) gemacht worden. Das Vorhandensein eines schlechten Geruches des Atems wurde benutzt, um gewisse Krankheiten zu erkennen. Jede VOC ist ein Teilindikator eines spezifischen Metabolismus oder einer spezifischen Krankheit, wie Atemwegerkrankungen, Leberkrankheit, usw. In meinen Untersuchungen fanden zwei unterschiedliche Spektroskopische Verfahren Anwendung: Protonentransfer-Reaktion-Massenspektrometrie (PTR-MS) und Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS). Das Vorhandensein von VOCs im Atem, und der Einfluß von unterschiedlichen Gesundheitszu- ständen auf die Produktion von VOCs wurden untersucht. Da diese Verfahren in der AG Heyne noch nicht angewendet worden waren, begannen wir mit Messungen, die die Reproduzierbarkeit der Messungen und die Abhängigkeit von anderen Parametern, wie das Verfahren zum Einsammeln der Atemluft, untersuchten. Hier betrachteten wir das zeitliche Verhalten der Konzentration der VOCs. Atemproben von Freiwilligen wurden eingesammelt und über die Dauer einer Woche untersucht. Dieser Teil der Studie wurde sowohl mit PTR-MS und IMS durchgeführt. Mit der PTR-MS erfolgten zwei Untersuchungen. Die erste war ein Vergleich von drei unterschiedlichen Gruppen von Probanden, die in unterschiedliche Gesundheitszutänden eingestuft waren. Die erste Gruppe waren Veganer, die als sehr gesund eingestuft waren. Die zweite waren gesunde Freiwillige. Die dritte waren Patienten der Charité. Jede VOC hat eine eigene Signatur, die von dem „Gesundheitszustand” bestimmt wird, und größer oder kleiner ist in Verglich zu anderen. In der zweiten Untersuchung wurde die Korrelation zwischen LiMAx-Wert (bei Patienten), VOC-Konzentration und Leberzustand gesucht. Eine weitere Studie wurde mit der IMS durchgeführt zur Bestimmung der Faktoren, die die VOC-Intensitäten - wie Diät, direktes Atmen gegenüber gesammelter Atem, und Rauchen -beeinflussen. Da wir feststellten, daß die Reproduzierkeit der IMS- Messung nicht zuverlässig war, und die Identifizierung von VOC-Linien weitgehend fehlten, wurden diese Resultate im Anhange angeführt