Evolution und Biogeographie von Buxus L. (Buxaceae) in Kuba und der Karibik

González Gutiérrez, Pedro Alejandro. 2014. Evolution and biogeography of Buxus L. (Buxaceae) in Cuba and the Caribbean. Doctoral thesis, Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie. Institut für Biologie/Botanik, Freie Universität Berlin, Germany. Buxus L. is the largest genus of the family Buxaceae, with c. 100 species distributed in all continents except Australia and Antarctica. The centres of morphological and ecological diversity of Buxus are the Caribbean, East Asia and Africa including Madagascar. Cuba is the territory with the highest number of Buxus taxa in the world. In Cuba a total of 37 species and seven subspecies of this genus occur, 95% of which are endemic. Most Cuban Buxus are endemic to the serpentine outcrops in east, central and west Cuba while a smaller number of species inhabits limestone areas of the island. About 50% of the Cuban Buxus accumulate or hyperaccumulate nickel (Ni), being the only members of the family Buxaceae with such ability. The adaptation to growth on serpentines and their capacity to accumulate or hyperaccumulate Ni appeared among the factors triggering the evolution of Buxus and other groups in the Cuban flora. For the reasons exposed above the Cuban and Caribbean Buxus are an appealing group for biogeographical and evolutionary studies. This study uses them as a model to address the following questions: (1) Are the Cuban and the other Caribbean Buxus a monophyletic group? (2) When did Buxus arrive in the Caribbean and when occurred the diversification of the genus on the islands? (3) What are now the closest relatives and were then the ancestors of Cuban and Caribbean Buxus and where did they occur? (4) Are there specific migration routes of Buxus in the Caribbean? and (5) Which factors have triggered the speciation of Buxus in Cuba? Following a detailed introduction that summarizes our current state of knowledge and reviews the existing literature, Chapter 2 of this thesis focuses on the phylogeny and biogeography of Buxus including a total of 53 species of Buxus, where 34 species and 5 subspecies are from Cuba (c. 90% of taxa known), several also from different localities, and also species from the Bahamas, Hispaniola, Jamaica, Mexico, Panama and Puerto Rico. Buxus representatives from Eurasia and Africa were also included. The outgroup includes all other genera of Buxales and representatives of Trochodendrales, Proteales, Sabiales and Ranunculales. A combined matrix of plastid sequences (trnL-F, petD and trnK- matK) was analysed. The results reveal the existence of three major clades within a monophyletic genus Buxus: An African clade, an American clade (representing the neotropics) and a Eurasian clade. In the American clade (1 PP / 100% JK) two major clades are recovered, a Mexican clade (1 PP / 58% JK) and a Caribbean clade (1 PP / 75% JK). The Mexican clade sister to the Caribbean clade encloses the Mexican species and a Cuban species, B. brevipes, from western Cuba. The rest of the Cuban and Caribbean species form a well resolved clade, in which B. jaucoensis is placed in a position sister to three strongly supported subclades, the “Gonoclada”-clade (1 PP / 98% JK), the “Shaferi”-clade (1 PP / 100% JK) and the “Glomerata”-clade (1 PP / 100% JK). Using a relaxed molecular clock, three calibrations points in outgroup and ingroup nodes [Buxales-Trochodendrales, Proteales-Sabiales, Euroasian Buxus - Pachysandra/Sarcococca/Styloceras] and the combined plastid data set evidence is provided that Buxus started to radiate in the Caribbean during the Middle Miocene and the individual subclades diversified during the Pliocene. The ancestral Buxus in the Caribbean was likely a non-serpentine species from eastern Cuba. The adaptation of the Cuban Buxus to grow on serpentines and further evolution to accumulate and hyperaccumulate Ni, likely triggered the diversification of Buxus in Cuba, showed through the high diversification rate in the “Gonoclada”-clade (0.78 sp. Myr-1). From east Cuba, Buxus migrated at least twice, once reaching central Cuba and a second time covering all areas in Cuba and other regions of the Caribbean. Migrations of Buxus within Cuba and to other regions of the Caribbean may have been favoured by hurricanes. Three new species of Buxus endemic to Sierra de Nipe and Sierra del Cristal, northeastern Cuba, are described (Chapter 3). Morphological descriptions, including pollen and leaf anatomy are provided as well as sequences of the plastid trnK-matK and trnL-trnF regions, serving as molecular descriptions. DNA characters were evaluated to find suitable states for a molecular diagnosis that complements the morphological diagnosis. Using the newly described species of Buxus as an example, prospects and pitfalls of DNA characters to support species diagnosis are discussed. Furthermore, an assessment of the distribution, habitat, ecology, and conservation status of the three newly recognized endemic species is provided. Chapter 4 entails a detailed analysis of the nuclear Internal Transcribed Spacer (ITS) region in the Caribbean and Cuban species of Buxus. This chapter aims to reconstruct a nuclear gene phylogeny and to compare it with a plastid tree in order to explore the existence of reticulate patterns (hybridization, introgression or incomplete lineage sorting) in the evolution of Buxus in Cuba and the Caribbean. The sampling of this study includes the same species used for the plastid analysis. The two internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) and the 5.8S gene were used as a marker system. Large amount of samples were cloned because of polymorphic sites and obviously diverging paralogues. Sequences were classified into putative pseudogenes and putative functional ribotypes after an examination of their length, Guanine-Cytosine (GC) content and the visual analysis of five sequence motifs located in ITS1 (1) and in 5.8S (4), which have been reported as conserved in functional copies in plants. Most of cloned samples yielded different paralogues, which show intra-individual polymorphism, indicating that in Buxus the concerted evolution in this region has not been fully operational. A high portion of ITS sequences were classified as putative pseudogenic ribotypes (71%). MP and BI analyses were conducted in a matrix of 293 accessions included all ITS sequences obtained from direct sequencing of PCR products and from cloning. Based on the aggrupation of the divergent putative pseudogenic ribotyps and putative functional ribotypes examples of stepwise pseudogenization could be detected for most of the species of the “Gonoclada”-clade. On the other hand the inconsistent position of the putative pseudogenic and putative functional ribotypes of B. shaferi could reflect saturation caused by pseudogenization. Additionally, the incongruent topology of the phylogenetic trees show that in Cuba and the Caribbean the evolution of Buxus has been driven by reticulate patterns. For example B. glomerata is involved several events of reticulation which suggest multiple ancient hybridizations. Chapter 5 is a study of haplotypes of two Cuban endemic species of Buxus, B. foliosa and B. shaferi. In the plastid phylogeny carried out in the chapter 2, accessions of these two species enclosed in the “Shaferi”-clade, were not monophyletic. Such a pattern could either be a consequence of incomplete lineage sorting or hybridization or of hitherto overlooked cryptic species that are morphologically very similar. The plastid marker trnK-matK was amplified and sequenced from 49 samples of these two species and a network analysis was conducted. Eight different haplotypes were found (H1 to H8), six of them exclusive of B. shaferi, one exclusive of B. foliosa and one shared by several samples of these two species collected in the same locality. The H8 of B. shaferi, from the southern slope of National Park Cristal (Sierra Cristal) is quite different from the other haplotypes of this species. This difference could be caused by geographic barriers limiting the action of the disperser agents. The existence of the same haplotype in samples of B. foliosa and B. shaferi from the locality of La Melba could be caused by incomplete lineage sorting or hybridization. The main results of the present study led to suggestions and further questions regarding the phylogeny of Buxus in the world and in the Caribbean area. Further phylogenetic studies in the genus Buxus should include representatives of the species distributed in the southeastern part of Asia. All the reticulation patterns detected within the Cuban and Caribbean Buxus should be investigated. For that it would be necessary to carry out cloning strategies of the ITS even with those samples, which yielded good pherograms from direct PCR products. Moreover it would be advisable to visit the relict populations of B. jaucoensis, B. gonoclada and B. sclerophylla in their locus classicus in order to collect more individuals. These new samples should be analysed to explore if their plastid and nuclear genomes support the hypothesis about hybridization suggested in the fourth chapter of this thesis. Another suggestion is to conduct a haplotypes study including other population of species included in the “Shaferi”-clade.González Gutiérrez, Pedro Alejandro. 2014. Evolution und Biogeographie von Buxus L. (Buxaceae) in Kuba und der Karibik. Doktorarbeit, Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie. Institut für Biologie/Botanik, Freie Universität Berlin, Deutschland. Buxus L. ist mit ca. 100 Arten die größte Gattung in der Familie der Buxaceae, und ist, außer in Australien und der Antarktis, auf allen Kontinenten verbreitet. Die Zentren der morphologischen und ökologischen Vielfalt von Buxus sind die Karibik, Ost-Asien, Afrika sowie Madagaskar. Kuba ist weltweit das Gebiet mit der größten Anzahl an Buxus Taxa. Es existieren insgesamt 37 Arten und 7 Unterarten dieser Gattung, von denen 95% endemisch sind. Die meisten kubanischen Buxus Arten sind endemisch auf Serpentinen- Aufschlüssen in Ost-, Zentral- und West Kuba, während eine kleinere Anzahl von Arten auf Kalksteingebieten der Insel vorkommen. Über 50% der kubanischen Buxus Arten akkumulieren oder hyperakkumulieren Nickel (Ni). Sie sind die einzigen Mitglieder der Familie der Buxaceae mit diesen Fähigkeiten. Die Anpassung auf Serpentinenboden wachsen zu können, und ihre Fähigkeit Nickel zu akkumulieren oder hyperakkumulieren erschienen als die Faktoren, welche die Evolution von Buxus und anderen Gruppen der kubanischen Flora beeinflussten. Aus diesen oben genannten Gründen sind die kubanischen und karibischen Buxus Arten eine attraktive Gruppe für biogeographische und evolutionäre Studien. Diese Arbeit nutzt Buxus als Modell um folgende Fragen zu beantworten: (1) Bilden die kubanischen und die anderen karibischen Buxus Arten eine monophyletische Gruppe? (2) Wann gelangte Buxus in die Karibik, und wann hatte sich die Gruppe auf den Inseln verbreitet? (3) Wer sind die nähsten Verwandten und Vorfahren der kubanischen und karibischen Buxus und wo waren diese verbrietet? (4) Gibt es spezifische Ausbreitungssrouten von Buxus in der Karibik? (5) Welche Faktoren haben die diversifizierung von Buxus auf Kuba ausgelöst? Nach einer ausführlichen Einleitung, die den aktuellen Wissensstand zusammenfast und einem Überblick über die vorhandene Literatur gibt, konzentriert sich die Arbeit des 2. Kapitels auf die Phylogenie und Biogeographie von Buxus (Buchsbäume), welche insgesamt 53 Arten beinhalten, wovon 34 Arten und 5 Unterarten aus Kuba stammen (ca. 90% der Taxa sind bekannt), etliche aus verschiedenen Lokalitäten sowie Arten von den Bahamas, Hispaniola, Jamaika, Mexiko, Panama und Puerto Rico. Ebenfalls enthalten sind Buxus Vertreter aus Eurasien und Afrika. Die Außengruppe umfasst alle anderen Gattungen der Buxales und Vertreter der Trochodendrales, Proteales, Sabiales und Ranunculales. Eine kombinierte Matrix aus Plastiden Sequenzen (trnL-F, petD und trnK/matK) wurde analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Existenz von drei Großgruppen innerhalb der monophyletischen Gattung Buxus: Eine afrikanische Klade, eine amerikanische Klade (als Vertreter der Neotropis) und eine eurasische Klade. In der amerikanischen Klade (1 PP / 100% JK) wurden zwei Hauptkladen wiedergefunden, eine mexikanische Klade (1 PP / JK 58%) und eine karibische Klade (1 PP / 75% JK). Die mexikanische Schwestergruppe in der karibischen Klade umfasst die mexikanischen Arten sowie eine kubanische Art, Buxus brevipes aus West-Kuba. Der Rest der kubanischen und karibischen Arten bildet eine gut aufgelöste Klade, in welcher Buxus jaucoensis zu drei stark unterstützten Untergruppen, der Gonoclada”-Klade (1 PP / 98% JK), der “Shaferi”-Klade (1 PP / 100% JK) und der “Glomerata”-Klade (1 PP / 100% JK) eine Schwester-Position einnimmt. Unter Verwendung eines „relaxed molecular clock“-Modells, drei Kalibrierungspunkten in den Knoten der Außen- und der Innengruppe [Buxales-Trochodendrales, Proteales-Sabiales, Euroasian Buxus -Pachysandra/Sarcococca/Styloceras], sowie des kombinierten Plastiden Datensatzes, konnte gezeigt werden, dass Buxus seine Radiation in der Karibik während des mittleren Miozän begann und die individuellen Unterkladen sich während des Pliozäns verbreiteten. Der Vorfahre der heutigen Buxus Arten aus der Karibik war wahrscheinlich eine nicht-serpentinische Art aus Ost-Kuba. Die Anpassung des kubanischen Buxus auf Serpentinenboden zu wachsen und die weitere Entwicklung Nickel zu akkumulieren oder zu hyperakkumulieren, war wahrscheinlich der Auslöser für die Diversifikation der Buxus auf Kuba, welche durch die hohe Diversifizierungsrate im “Gonoclada”-Klade (0.78 sp. Myr-1) gezeigt wird. Die Buxus Ausbreitung von Ost-Kuba aus, fand mindestens zweimal statt, einmal erreichte es Zentralkuba und ein zweites Mal alle Bereiche Kubas und andere Regionen der Karibik. Die Ausbreitung von Buxus in Kuba und anderen Regionen der Karibik könnte durch Wirbelstürme begünstigt worden sein. Drei neue Arten von Buxus, die endemisch in der Sierra de Nipe und Sierra del Cristal, im Nordosten Kubas sind, werden im Kapitel 3 beschrieben. Morphologische Beschreibungen, einschließlich Pollen- und Blattanatomie werden genauso wie Sequenzen der Plastiden-Regionen trnK/matK und trnL-trnF, die als molekulare Beschreibung dienen, bereitgestellt. Geeignete molekuare Merkmale (DNS Mutationen) wurden gesucht, um die morphologische Diagnose zu ergänzen. Mit den neu beschriebenen Arten von Buxus als Beispiel, werden die Perspektiven und Probleme der molekularen Diagnose als Bestandteil der Artbeschreibung diskutiert. Des Weiteren ist eine Bewertung der Verbreitung, des Habitats, der Ökologie und des Gefährdungsstatus bereitgestellt. Kapitel 4 beinhaltet eine detaillierte Analyse über die nukleäre „Internal Transcribed Spacer“ (ITS) Region der karibischen und kubanischen Arten des Buxus. Das Ziel dieses Kapitels ist es, eine nukleäre Gen-Phylogenie zu rekonstruieren und mit einem Plastiden-Baum zu vergleichen, um die Existenz retikulärer Muster (Hybidisierung, Einkreuzung oder „Incomplete lineage sorting“) in der Evolution des Buxus in Kuba und der Karibik zu erkunden. Die Probennahme dieser Studie umfasst die gleichen Arten, welche auch für die Plastiden- Analyse genutzt wurden. Als Marker-System wurden die beiden „Internal transcribed spacers“ (ITS1 und ITS2) und das 5.8S Gen verwendet. Große Mengen an Proben wurden wegen polymorpher Stellen und offensichtlich divergierenden Paralogen kloniert. Die Sequenzen wurden nach einer Prüfung ihrer Länge, ihres Guanin-Cytosin (GC) Gehalts und der visuellen Analyse von fünf Sequenz- Motiven, die sich in ITS1 (1) und 5.8S (4) befinden, welche als funktionale Kopien in Pflanzen angezeigt werden, in mögliche Pseudogene und mögliche funktionelle Ribotypen klassifiziert. Die meisten der klonierten Proben ergaben unterschiedliche Paraloge, die intra-individuellen Polymorphismus zeigten, was darauf hindeutet, dass in Buxus die Evolution in dieser Region noch nicht voll funktionsfähig ist. Ein großer Anteil an ITS-Sequenzen wurde als mögliche Pseudogen-Ribotypen (71%) eingestuft. Maximum Parsiony und Bayes‘sche Analysen wurden mit einer Matrix aus 293 Akzessionen durchgeführt, welche alle ITS Sequenzen mit einbezogen und durch direkte Sequenzierung von PCR-Produkten und durch Klonierung erhalten wurden. Basierend auf der Gruppierung der divergenten putativen Pseudogene und funktionalen Ribotypen, konnten Beispiele der schrittweisen Pseudogenisierung für die meisten Arten der "Gonoclada"-Klade nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite könnte die uneinheitliche Position der möglichen Pseudogene und funktionalen Ribotypen von B. shaferi die Sättigung aufgrund von Pseudogenisation darstellen. Zusätzlich zeigt die inkongruente Topologie der phylogenetischen Bäume, dass in Kuba und der Karibik die Evolution von Buxus von retikuläre Muster vorkommen. Zum Beispiel ist B. glomerata an mehreren Retikulationen beteiligt, was auf mehrfache Hybridisierungen hindeutet. Kapitel 5 beschäftigt sich mit einer Haplotypen-Studie von zwei kubanischen endemischen Buxus-Arten, B. foliosa and B. shaferi. Die Plastiden Phylogenie, welche im Kapitel 2 durchgeführt wurde, zeigt, dass diese zwei Arten, welche dem „Shaferi“-Klade beigefügt werden, nicht monophyletisch sind. Ein solches Muster könnte entweder die Folge von „incomplete lineage sorting“ oder Hybridisierung sein, oder von bisher übersehenen kryptischen Arten stammen, die morphologisch sehr ähnlich sind. Die Plastiden-Marker trnK/matK von 49 Proben dieser zwei Arten wurden amplifiziert und sequenziert und damit eine Netzwerk-Analyse durchgeführt. Acht verschiedene Haplotypen wurden gefunden (H1 bis H8), sechs davon exklusiv von B. shaferi, eine exklusive von B. foliosa und eine geteilt von mehreren Proben dieser beider Arten, welche an dem gleichen Ort gesammelt wurden. Der Haplotyp (H8) von B. shaferi, vom Südhang des Nationalparks Cristal (Sierra Cristal) ist ganz anders als die anderen Haplotypen dieser Art. Diese Unterschiede könnten durch geographische Grenzen, welche die Ausbreitung limitieren, begründet sein. Die Existenz der gleichen Haplotypen in den Proben von B. foliosa und B. shaferi aus der Ortschaft La Melba könnte durch “incomplete lineage sorting“ oder Hybridisierung verursacht werden. Die wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Studie führten zu Anregungen und weiteren Fragen in Bezug auf die Phylogenie von Buxus in der Welt und in der Karibik. Weitere phylogenetische Studien in der Gattung Buxus sollten Vertreter der Art, welche im südöstlichen Teil Asiens verbreitet sind, umfassen. Alle Retikulations-Muster, die in den kubanischen und karibischen Buxus entdeckt wurden, sollten untersucht werden. Dafür wäre es notwendig, für ITS eine Klonierungsstrategie zu entwickeln, sogar mit den Proben, welche ein gutes Pherogramm vom direkten PCR-Produkt ergaben. Darüber hinaus wäre es sinnvoll die Reliktpopulationen von B. jaucoensis, B. gonoclada und B. sclerophylla in ihrem Herkunftsort zu besuchen um mehr Individuen zu sammeln. Diese neuen Proben sollten analysiert werden, um zu erkunden, ob ihr Plastiden- und Kerngenome die Hypothese über die Hybridisierung unterstützen, welche im vierten Kapitel dieser Arbeit diskutiert wurde. Ein weiterer Vorschlag wäre, eine Studie zu anderen Hyplotypen durchzuführen, welche andere Populationen von Arten des „Shaferi“-Klade umfasse