Renal epithelial transport systems in the pathogenesis of idiopathic hypercalciuria and primary noturnal enuresis

1\. Titel 1a. Inhaltsverzeichnis 2\. Einleitung 1 3\. Kapitel 1 23 4\. Kapitel 2 33 5\. Kapitel 3 49 6\. Kapitel 4 57 7\. Kapitel 5 67 8\. Kapitel 6 71 9\. Kapitel 7 76 10\. Kapitel 8 88 11\. Kapitel 9 100 12\. Kapitel 10 104 13\. Diskussion 108 14\. Zusammenfassung 122 15\. Literaturverzeichnis 125 16\. Anhang 150Epithelien bilden nicht nur eine Barriere zwischen verschiedenen Kompartimenten, sondern besitzen auch die Möglichkeit, Substanzen von einer Seite dieser Barriere auf die andere Seite zu transportieren. Meist besitzen solche Transportsysteme eine Spezifität für die zu transportierende Substanz und der Transport erfolgt gerichtet von apikal nach basolateral. Prinzipiell stehen zwei Möglichkeiten für den epithelialen Transport zur Verfügung. Der transzelluläre Transport bedingt den Eintritt eines Moleküls in die Zelle, dessen Transport zur basolateralen Membran und dessen Extrusion über diese Membran aus der Zelle hinaus. Der parazelluläre Transportweg verläuft zwischen zwei benachbarten Zellen hindurch. Die Substratspezifität wird bedingt durch membranständige Proteine, die zum Aufbau der Tight Junction, einer supramolekularen Struktureinheit, beitragen. Ziel vorliegender Arbeit war es, die Beziehung von epithelialen renalen Transportsystemen zu zwei häufigen pädiatrischen Krankheitsbildern, der idiopathischen Hyperkalziurie und der primären Enuresis nocturna (PEN) zu untersuchen. Die idiopathische Hyperkalziurie ist definiert als erhöhte renale Ca2+-Exkretion. Im Kindesalter ist sie assoziiert mit Urolithiasis, Nephrokalzinose, Harnwegsinfekten, Dranginkontinenz und wird auch als Ursache der PEN diskutiert. Angenommen wird ein primärer renaler Defekt der Ca2+-Rückresorption sowie eine intestinale Ca2+-Hyperabsorption mit sekundärer Hyperkalziurie, eine molekulare Ursache konnte bisher nicht identifiziert werden. In dieser Arbeit wurde der renale epitheliale Ca2+-Kanal TRPV5 charakterisiert und auf dessen Rolle bei der Pathogenese der idiopathischen Hyperkalziurie überprüft. TRPV5 wird im DCT exprimiert und stellt dort den apikalen Ca2+-Eintrittsmechanismus dar. Ebenso konnte hier gezeigt werden, dass TRPV5 positiv durch Calcitriol reguliert wird. Eine Mutationsanalyse bei 9 Familien mit autosomal dominant vererbter idiopathischer Hyperkalziurie konnte Mutationen im TRPV5-Gen als Ursache der Erkrankung ausschließen. Bei zwei weiteren Familien mit autosomal-rezessiv vererbter Hyperkalziurie konnte eine neue Mutation im Tight Junction Protein CLDN-16 identifiziert werden. Mutationen im CLDN-16-Gen führen zur familiären Hypomagnesiämie mit Hyperkalziurie und Nephrokalzinose (FHHNC). Im Gegensatz zu Patienten mit FHHNC lag bei den Betroffenen beider Familien eine niedrig normale Mg2+-Konzentration im Serum vor, die Hyperkalziurie bestand nur während der Kindheit und normalisierte sich im Erwachsenenalter. Als molekulare Ursache dieses Phänotyps konnte eine fehlende Interaktion zwischen der CLDN-16 Mutante (T233R) und dem intrazellulären Adapterprotein ZO-1 demonstriert werden, welches hier als endogener Ligand identifiziert wurde. Damit konnte ein neuer Pathomechanismus aufgedeckt werden, der möglicherweise auch bei anderen, bisher nicht aufgeklärten epithelialen Transportdefekten eine wichtige Rolle spielt. Der Phänotyp impliziert, dass CLDN-16 einen Mg2+-spezifischen parazellulären Kanal formiert und der Ca2+-Verlust ein sekundäres Phänomen darstellt. In vorliegender Arbeit konnte auch die Hypothese der Hyperkalziurie als Ursache der PEN widerlegt werden. Stattdessen konnte gezeigt werden, dass die Gabe von dDAVP bei der Behandlung der PEN zu einer vermehrten renalen Ca2+ Exkretion führt. In der Literatur wird der erfolgreiche Einsatz von dDAVP bei der PEN mit dessen antidiuretischer Wirkung und mit Berichten über eine inadäquate nächtliche ADH-Sekretion bei Kindern mit PEN begründet. Hier konnte jedoch hier gezeigt werden, dass dDAVP bei Patienten, die gleichzeitig an nephrogenem Diabetes insipidus und primärer Enuresis nocturna litten, zu einem Sistieren der PEN führte. Da bei Patienten mit nephrogenem Diabetes insipidus, hier bedingt durch Mutationen im AQP-2 Gen, keine renale H2O-Rückresorption erfolgt, muss der therapeutische Effekt durch eine nicht-renale Wirkung vermittelt werden. Durch zwei weitere klinische Studien konnte bewiesen werden, dass dieser therapeutische Effekt von dDAVP durch dessen Wirkung auf das Zentralnervensystem bedingt ist. Diese Untersuchungen zeigen anhand von zwei pädiatrischen Krankheitsbildern, dass die molekulare und klinische Analyse renaler epithelialer Transportsysteme wichtige Aufschlüsse für das Verständnis hereditärer Erkrankungen liefern kann. Zukünftige Studien dieser Systeme werden deren Funktion und Regulation genauer charakterisieren und damit die Grundlage zur differentiellen Diagnostik und Therapie komplexer Störungen liefern.Epithelia not only separate different compartments but exhibit also the ability to transport molecules across this barrier. In general, such systems display a certain substrate specifity and the transport is unidirectional from apical to basolateral. There are two basic possibilities of epithelial transport. Transcellular transport is realized by the apical entry of a substrate into the cell, its transport to the basolateral side and the extrusion into the extracellular space. Paracellular transport is directed through the space of two neighboring cells. Substrate specifity is provided by the membrane-associated proteins of the tight junction, a supramolecular structural unit. Goal of this work was to elucidate the role of epithelial renal transport systems in two common pediatric disorders, idiopathic hypercalciuria and primary nocturnal enuresis (PNE). Idiopathic hypercalciuria is defined as increased renal Ca2+-excretion. In childhood, the disorder is associated with urolithiasis, nephrocalcinosis, infections of the urinary tract, urge incontinence and is supposed to be one of the causes of PNE. A renal as well as an intestinal Ca2+-loss are discussed as the underlying cause, however, the molecular basis remains unknown. Here, the renal epithelial Ca2+-Channel TRPV5 has been characterized and then investigated for its role in the pathogenesis of idiopathic hyperclaciuria. TRPV5 is expressed in the distal convoluted tubule and provides there the apical Ca2+-entry mechanism into the cell. Furthermore, it was demonstrated that TRPV5 is regulated by calcitriol. A mutational analysis in 9 families with autosomal dominant idiopathic hyperclaciuria precluded the role of TRPV5 as the primary defect in this disease. In two different families with autosomal recessive hypercalciuria, a novel mutation in the gene of the renal tight junction protein Claudin-16 (CLDN-16) was identified. Mutations in CLDN-16 lead to familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis (FHHNC). In contrast to patients with classical FHHNC, the patients identified here displayed only a low normal Mg2+ concentration the serum. Hypercalciuria was only present during childhood and normalized with adulthood. As the molecular cause, a lacking interaction between the mutant CLDN-16 protein an ist intracellular adapter protein, ZO-1, was identified. In this way a novel pathomechnism was identified which might also explain other, so far unidentified epithelial transport defects. The phenotype of the patients implies that CLDN-16 constitutes a paracellular Mg2+ channel and that urinary Ca2+ waste is a secondary phenomenon. In this work, the hypothesis of hypercalciuria as the underlying pathomechnism of PNE was proved wrong. Instead, it was demonstrated that the administration of desmopressin in the treatment of PNE causes an increased renal Ca2+-waste. The success of desmopressin in the PNE treatment has been expained with its antidiuretic mode of action in PNE patients with insufficient nighty endogenous arginine- vasopressin-secretion In this work, however, it was demonstrated that the administration of demopressin in patients that suffer from two disorders, PNE and nephrogenic diabetes insipidus caused the disappearence of PNE. Since patients with nephrogenic diabetes insipidus lack, due to a mutation in the renal water channel gene, aquaporin-2 (AQP-2) a functioning urinary concentration system, it is hypothesized that the beneficial effect of demopressin in PNE must be the consequence of a non-renal action. Two further studies proved that indeed the primary target organ of desmopressin in PNE is the central nervous sysetem. Together, the investigations in two common pediatric disorders demonstrate that the molecular and genetic analysis of renal epithelial transport systems provide important clues for the elucidation of underlying pathomechanisms. Future studies of these systems will reveal a more detailed molecular mode of action and will provide the basis of differential diagnostics and therapeutic interventions