FACS- and expression analysis of the ovine osteotomy and soft tissue hematoma 24, 36 and 48 hours after osteotomy

Nach wie vor kommt es im Bereich der Frakturheilung immer wieder zu Komplikationen in Form von Heilungsstörungen oder Pseudarthrosenbildung (Haas, 2000). Im Rahmen dieses Projektes wurde am Schafmodell eine Defekt-Osteotomie zur Gewinnung des Osteotomiehämatoms durchgeführt und diese mit einem rigiden Fixateur extern versorgt. Zu Vergleichszwecken wurde ein Muskelschaden zugefügt, um ein Weichteilhämatom entstehen zu lassen. Ziel des Vorhabens war es, die zelluläre Zusammensetzung beider Hämatome und die Expression unterschiedlicher Zytokine, Wachstumsfaktoren, Transkriptionsfaktoren, transmembraner Transport- und extrazellulärer Matrixproteine zu ermitteln. Gerade im Bereich des Entzündungsprozesses gibt es in der Frakturheilung deutliche Unterschiede im Vergleich zu einem Weichteilschaden. Proinflammatorische Zellen sind insgesamt im Osteotomiehämatom weniger vorhanden als im Weichteilhämatom. Dafür zeigen sich proinflammatorische Faktoren mit einer wesentlich größeren Intensität als im Weichteilhämatom. Im Osteotomiehämatom werden antiinflammatorische Faktoren deutlich stärker hochreguliert, genauso wie antiinflammatorische T-Helfer-Zellen in größerer Anzahl zu finden sind. Es ist daher zu vermuten, dass der Grund für eine narbenlose Heilung einer Fraktur in der Regulierung der Entzündungsreaktion zu suchen ist. Dies wird umso deutlicher, als die frühe Hochregulation der angiogenen Faktoren, die zeitgleich mit der Hochregulation antiinflammatorischer Faktoren einsetzt, eine schnelle Revaskularisierung andeuten. Die Wiederherstellung der Versorgung, der Zustrom migrierender, an der Heilung beteiligter Zellen über die neu entstandenen Gefäße, der Abtransport von Zellmüll und Abbauprodukten sind essentiell für eine erfolgreiche Heilung. Die Einteilung der Frakturheilung in vier sich überlappende Phasen (siehe Abb. 1.1.) ist geläufig und anerkannt. Mit Hilfe dieses Versuchsvorhabens konnten die Abläufe der Anfangsphase konkretisiert werden. Unmittelbar nach dem Entstehen einer Fraktur kommt es zu einem Anstieg proinflammatorischer Faktoren. Gleichzeitig wird die Schädigung des Gewebes, vor allem der Gefäße, deutlich sichtbar am Anstieg der Hypoxiemarker. Bereits nach 1 bis 4 Stunden ist die Hypoxie im Osteotomiehämatom sehr ausgeprägt. Sowohl die Entzündung als auch die Hypoxie sind im Weichteilschaden nicht so stark ausgebildet wie nach einer Knochenverletzung. Die Untersuchungen zeigen, dass nach einer Fraktur sehr schnell die Regulation sowohl der Entzündung als auch der Hypoxie einsetzt. Dies geschieht einerseits auf molekularer und andererseits auf zellulärer Ebene. Dabei ist hervorzuheben, dass der Anstieg antiinflammatorischer und angiogenetischer Faktoren zeitgleich beginnt. Osteogene Faktoren treten bereits nach 24 Stunden auf, so dass davon ausgegangen werden kann, dass der Grundstein einer festen Überbrückung des Osteotomiespaltes bereits sehr zeitig gelegt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit machen deutlich, dass die Entzündungsphase, als initiale Phase der Frakturheilung, richtungweisend für das resultierende Heilungsergebnis ist. Ein differenzierteres Verständnis der immunologischen Prozesse zu Beginn der Knochenheilung ist der erste Schritt zur Entwicklung vielversprechender neuer Therapieansätze. Denkbar ist hier die Beeinflussung der Entzündungsreaktion sowohl auf molekularer als auch auf zellulärer Ebene. Neueste Untersuchungen zeigen einen Zusammenhang zwischen CD8+ T-Zellen, also negativ beeinflussenden Immunzellpopulationen, und einer verzögerten Knochenheilung (Reinke et al., 2013). Die Ausschaltung solcher Zellen könnte die positive Beeinflussung der Regeneration ermöglichen. Außerdem ist es denkbar, der Fraktur Faktoren zuzufügen, die das Modellieren der zeitigen Phase der Frakturheilung ermöglichen. BMPs werden bereits erfolgreich in der Praxis eingesetzt. Der Einsatz antiinflammatorischer Faktoren wie TGF β und IL-10 zur Eindämmung der Inflammation sollte weiter untersucht werden. Auch die Beeinflussung mesenchymaler Stammzellen durch TGF β und regulatorische T-Zellen und damit eine Reduzierung der Entzündungsreaktion ist ein weiterer Ansatzpunkt für Weiterentwicklungen. Die Wiederherstellung des Blutgefäßsystems ist ebenfalls essentiell für eine erfolgreiche Frakturheilung. Der Einsatz angiogenetischer Faktoren wie PDGF, VEGF und OPN während der Frakturheilung stellt einen weiteren Ansatzpunkt dar, neue Entwicklungen voranzutreiben.Complications during fracture healing in form of healing disorders or non- union still occur (Haas, 2000). In this project, a defect osteotomy on a sheep model was performed to obtain a fracture hematoma. The fracture was provided with a rigid external fixator. For comparison purposes, a muscle damage has been done to cause a soft tissue hematoma. The aim of the project was to determine the cellular composition of both hematoma and the expression of various cytokines, growth factors, transcription factors, transmembrane transport- and extracellular matrix proteins. Especially at the inflammatory processes, there are significant differences in fracture healing compared to soft tissue injuries. In osteotomy hematoma are less inflammatory cells available than in soft tissue hematoma. In return, proinflammatory factors show a much greater intensity than in the soft tissue hematoma. Antiinflammatory factors are significantly stronger upregulated in the osteotomy hematoma as well as antiinflammatory T helper cells are found in larger numbers. It is therefore likely that the reason for the scarless healing of a fracture is a result of the regulation of the inflammatory response. This gets more evident as early upregulation of angiogenic factors, which begins simultaneously with the upregulation of antiinflammatory factors, suggesting a rapid revascularization. The restoration of blood supply, the influx of migrating cells, which are involved in healing of the newly established vessels, the removal of cellular waste and degradation products are essential for successful healing. The classification of fracture healing in four overlapping phases (see fig. 1.1.) is well known and accepted. Using this experimental project, the processes of the initial phase has been substantiated. Immediately after the emergence of a fracture there is an increase of proinflammatory factors. At the same time, the damage to the tissue, especially of the vessels is clearly visible on the increase of the hypoxic marker. After 1 to 4 hours in the osteotomy hematoma the hypoxia is very pronounced. Both the inflammation and the hypoxia in the soft tissue injury are not as strongly developed as after a bone injury. The studies show that after a fracture the regulation of inflammation and hypoxia starts very quickly. This is done on the one hand on the molecular and on the other hand at the cellular level. It should be emphasized that the increase of antiinflammatory and angiogenic factors starts simultaneously. Osteogenic factors already appear after 24 hours. It can be assumed that the foundation of a solid bridgingof the osteotomy gap is set very early. The results of this work show that the initial healing phase, the inflammatory phase, gives the direction for the healing outcome. A more differentiated understanding of the immunological processes at the beginning of bone healing is the first step towards the development of promising new therapeutic approaches. The influence of the inflammatory response both at the molecular and the cellular level is conceivable. Recent studies show an association between CD8+ T cells, means negatively influencing immune cell populations, and delayed bone healing (Reinke et al., 2013). The elimination of such cells could provide the positive influence of regeneration. It is also conceivable to add factors, allowing the modeling of the early phase of fracture healing. BMPs have been successfully used in practice. The use of antiinflammatory factors such as TGF β and IL-10 to stem inflammation should be further investigated. Also the influence of mesenchymal stem cells by TGF β and regulatory T-cells, and as a result a reduction of the inflammatory response is another starting point for further developments. The restoration of the vascular system is also essential for successful fracture healing. The use of angiogenic factors such as PDGF, VEGF and OPN during fracture healing is another approach to promote new developments