Bacterial toxins are contributors of neuronal apoptosis in a neonatal meningitis-model

GesamtdissertationEine bakterielle Meningitis im Neugeborenenalter kann besonders folgenschwer für die weitere Entwicklung des Patienten sein. Während einer bakteriellen Meningitis kommt es zum permanenten Verlust von Neuronen, besonders im Kortex und Gyrus dentatus. Dieser Neuronenuntergang könnte die Erklärung für die verschiedenen neurologischen Defizite sein, unter denen Patienten nach einer Meningitis leiden. Die genauen Mechanismen dieser Neuronenschädigung sind bisher noch nicht vollständig geklärt. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Poren-formenden Toxine Pneumolysin und beta-Hämolysin in der Pathogenese der neuronalen Schädigung zu untersuchen. Dazu wurde ein Meningitismodell in der neonatalen Ratte etabliert. Die Entzündung wurde durch intrazisternale Injektion von einem Pneumokokken- und einem GBS-Stamm sowie entsprechender Toxin-defizienter Mutanten in sieben Tage alten Ratten induziert. Der Nachweis der Meningitis erfolgte durch Bestimmung der Leukozytenzahl und des Bakterienwachstums im Liquor. Mittels eines klinischen Scores erfolgte die Untersuchung und Beurteilung des Allgemeinzustandes der Tiere. Mit Hilfe der Hämatoxylin-/Eosin- und der TUNEL-Methode erfolgte die Detektion neuronaler Schädigung im Kortex und im Hippokampus. Typische Eigenschaften des programmierten Zelltodes wie Zellschrumpfung und Kernkondensation und DNA- Doppelstrangbrüche konnten auf diese Weise dargestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass alle verwendeten Pneumokokken- und GBS-Stämme in der Lage waren, in unserem Modell eine Meningitis zu induzieren. Dabei zeigten sich keine Veränderung der Pleozytose und kein signifikanter Unterschied in der Bakterienzahl im Liquor zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen. Bei der klinischen Untersuchung zeigten sich hingegen signifikante Unterschiede zwischen den mit Wildtyp-Stämmen und den mit Bakterien-Mutanten infizierten Tieren. Sowohl die Abwesenheit von Pneumolysin bei der Pneumokokken-, als auch von Hämolysin bei der GBS-Meningitis, führten zu einer signifikanten Verbesserung des klinischen Zustandes. Die Verwendung der Toxin-defizienten Mutanten von S. pneumoniae und S. agalactiae (plnA-; spxB-; plnA-/spxB- und COH-1cylE∆cat) führte zu einer Reduktion der kortikalen und hippokampalen Apoptoserate verglichen mit den Wildtypgruppen. Diese Daten stehen in engem Zusammenhang mit dem klinischen Score: ein geringerer Neuronenverlust ging mit einer Verbesserung des klinischen Zustandes einher. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind von besonderer klinischer Relevanz, da diese Toxine sowohl von lebenden Bakterien, als auch bei der durch Antibiotika induzierten Bakterienlyse freigesetzt werden. Ein wichtiger Aspekt ist auch, dass durch die zunehmende Resistenzentwicklung in Zukunft von einer längeren Persistenz lebender Bakterien im Gehirn ausgegangen werden muss. Dies könnte zu einer vermehrten Freisetzung der bakteriellen Neurotoxine führen. Perspektivisch sind die molekularen Mechanismen des Zelltodes durch Poren-bildende Toxine zu klären sowie weitere bakterielle Toxine als Neurotoxine zu identifizieren. Die rasche Verfügbarkeit molekularer Techniken zur Erregeridentifikation könnte spezifische Interventionen z.B. mit Antikörpern gegen solche Neurotoxine ermöglichen.Bacterial meningitis of human infants often causes major neurological sequelae and developmental impairments. During bacterial meningitis neurons are permanently lost, especially in the cortex in dentate gyrus. This neuronal loss may explain several neurological deficits from which patients are suffering after meningitis. The exact mechanisms of neuronal damage in bacterial meningitis are not completely known. It was the goal of this work to investigate the role of the pore-forming toxins pneumolysin and beta- hemolysins in the pathogenesis of neuronal damage. Therefore, a neonatal rat meningitis model was established. Meningitis was induced by intracisternal injection of pneumococci or group B streptococci or their toxin-deficient mutants into seven day old rats. Meningitis was proofed by counting leukocytes and bacterial colonies in the cerebrospinal fluid. A clinical score was used to judge the condition of the animals. Neuronal damage in cortex and hippocampus was detected with hematoxylin&eosin; and TUNEL stainings. This proofed characteristical signs of programmed cell death such as cell shrinkage, nuclear condensation and DNA double strand breaks. All pneumococcal and GBS strains induced meningitis in our model. Cerebrospinal pleocytosis and bacterial numbers did not differ significantly between all groups. However, the clinical scores of rats infected with wild type or mutant bacteria differed significantly. Either absence of pneumolysin in pneumococcal meningitis or hemolysin in GBS meningitis caused a less deterioration of the clinical score. Compared to their respective wild type bacteria, pneumolysin- deficient or hydrogen peroxide-deficient S. pneumoniae or hemolysin-deficient S. agalactiae induced an attenuated rate of apoptosis of cortical and hippocampal neurons. These data were in close correlation with the clinical score: an attenuated loss of neurons was paralleled with an improvement of the clinical score. The results of this work are of high clinical significance, because these toxins are released from live bacteria and during antibiotica- induced bacterial lysis. Another important aspect is that due to the increase of bacterial resistance bacteria may longer persist in the cerebrospinal fluid compartment. This may result in an increased release of bacterial toxins. The molecular mechanisms cell death induced by pore-forming and other toxins need further clarification. The rapid identification of the pathogen by molecular techniques could enable specific interventions to neutralize these neurotoxins, e.g., with antibodies