The combinatory stimulation of Toll-like receptors on dendritic cells and its effect on the polarization of CD4+T-cells

Die Antigen präsentierenden Zellen der Haut sind die dermalen DC und die epidermalen LC. Obwohl LC die erst beschriebenen DC darstellen und in vielen Versuchen als Modell für diese fungieren, ist wenig über ihre physiologische Funktion und Partizipation bei Erkrankungen der Haut bekannt. Nun können bei inflammatorischen Erkrankungen wie Psoriasis, atopischer Dermatitis und allergischer Kontaktdermatitis vermehrt TH17- und TH22-Zellen in der Haut nachgewiesen werden. Besonders die Psoriasis wird mit einem bestimmten Zytokinmilieu, bestehend aus IFN-γ, TNF-α, IL 17 und IL-22, assoziiert. In Versuchen an LC konnte bereits nachgewiesen werden, dass diese prinzipiell dazu befähigt sind, TH17- und TH22-Zellen zu induzieren. Speziell die Stimulation des TLR2 führt zur Sekretion induktionskritischer Zytokine, wie IL-6 und IL-1β. In der vorliegenden Arbeit wurde an aus adhärierten Monozyten generierten MoLC und MoDC die multi-PAMP-Exposition, wie sie in vivo bei Verlust der epidermalen Barrierenfunktion und direkter Exposition der Erreger anzutreffen ist, untersucht. Es konnte auf Ebene der DC-Reifung und Sekretion von TH1/TH17/TH22-induzierenden Zytokinen, wie IL-6, IL-1β und IL-23, ein Synergismus unterschiedlicher TLR-Liganden nachgewiesen werden. Dieser hatte eine synergistische Hoch-Regulierung der Sekretion von TNF-α und IL-22 in der Kokultur der MoLC mit CD4+T-Zellen zur Folge. Die Induktion der IL-17-Produktion in CD4+T-Zellen korrelierte nicht mit der Sekretion von IL-6, IL-1β oder IL-23 durch die MoLC. Es konnte gezeigt werden, dass die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine IL 6, TNF-α sowie IL-12p70, IL-23 und IL-1β nach TLR2-Stimulation in MoDC und MoLC unterschiedlich reguliert wird. Interessanterweise fehlte MoLC im Gegensatz zu MoDC die Fähigkeit zur Produktion von IL-12p70. Nach Stimulation mit PGN in Verbindung mit CD40L sezernierten die MoLC geringe Mengen IL-12p70. Die Freisetzung von IL-1β wurde synergistisch beeinflusst. In MoDC hingegen wurde die Sekretion von IL-12p70 und nicht IL-1β synergistisch hoch reguliert. Auch die kooperativen Effekte unterschiedlicher TLR-Agonisten bei simultaner Stimulation prägten sich in MoDC und MoLC verschieden aus. So führte die gleichzeitige Stimulation des TLR4, der Schnittstelle zwischen der Signal-transduktion von TRIF und MyD88, mit LPS und des TRIF-assoziierten TLR3 mit PolyI:C in MoLC zur synergistischen Sekretion von IL-6, IL-1β und IL-12p70 und damit zu einem Synergismus, der sich bei bisherigen Untersuchungen anderer DC-Populationen nicht einstellte. Ebenso konnte erstmalig an humanen Zellen ein synergistischer Effekt der simultanen Stimulation des TLR2 und des TLR4 nachgewiesen werden. MoLC, die über den TLR2 durch PGN oder im Speziellen das Heterodimer TLR2/6 durch MALP-2 in Kombination mit dem TLR4 durch LPS stimuliert wurden, setzten synergistisch IL-6, IL-1β und IL-23 frei. In MoDC wurde die Sekretion von IL-12p70 und in pDC die Sekretion von IL-23 durch simultane Stimulation des TLR2 und TLR4 synergistisch hoch reguliert. Das Heterodimer TLR2/6 schien hierbei von kritischer Bedeutung für die synergistischen Effekte zu sein. Die Stimulation anderer MyD88-gekoppelter TLR, wie des TLR1/2 durch Pam3, des TLR5 durch Flagellin oder des TLR9 durch bakterielle DNS, zeigten bei gleichzeitiger Stimulation des TLR4 durch LPS keine Synergismen. Wie die Synergismen auf Signaltransduktionsebene und ob sie durch eine mögliche Hoch Regulierung der TLR-Expression entstehen, wird in weiteren Studien zu untersuchen sein. Neben den Synergismen bezüglich der Zytokinsekretion wurde auch die Expression der Reifungsmarker und kostimulatorischen Moleküle CD40, CD54, CD86, HLA-DR und CCR7 auf der Plasmamembran der MoLC bei kombinierter Stimulation durch PGN mit LPS oder DNS hoch reguliert. In der Kokultur förderten LPS oder PGN stimulierte MoLC die IL-17-Produktion durch CD4+T-Zellen. Ein synergistischer Effekt konnte für die Kombination von LPS und DNS nachgewiesen werden, was eine über Zell-Zell-Kontakte vermittelte Induktion der IL-17-Produktion suggeriert. IFN-γ hingegen wurde nicht durch die kombi-natorische Stimulation der TLR beeinflusst. Als Einzelstimulus und in Kombination führte LPS zu einer Hoch-Regulierung der IL-17+IFN-γ+Zellen, die einen gemischten TH1/TH17-Phänotyp repräsentieren können. Die simultane Stimulation des TLR2 und TLR4 oder des TLR2, TLR4 und TLR9 zeigte synergistische Effekte auf die Expansion der TH22-Population und die Hoch-Regulierung der IL-22-Sekretion. Die IL 22-Produktion korrelierte mit TNF-α und dem durch MoLC freigesetzten IL-6, zwei essentiellen Faktoren der TH22-Differenzierung. PGN und LPS, zwei Moleküle der Bakterienzellwand, zeigten insgesamt stark unterstützende Wirkung in der Aktivierung von DC und der nachgeschalteten TH-Differenzierung und Zytokinfreisetzung.The antigen presenting cells of the skin are the dermal dendritic cells (DCs) and the epidermal Langerhans-cells (LCs). Although LCs represent the first described DC-population and are used as model cells in many studies, little is known about their physiological function and participation in skin diseases. In inflammatory diseases like psoriasis, atopic dermatitis and allergic contact dermatitis increased amounts of TH17- and TH22-cells are found in the skin. Notably psoriasis is associated with a distinct cytokine milieu, consisting of IFN-γ, TNF-α, IL 17 and IL-22. In studies it already has been shown, that LCs are generally capable to induce TH17- and TH22-cells. Especially the stimulation of the TLR2 leads to the secretion of cytokines that are critical for the induction of these TH-populations, like IL 6 and IL- 1β. In this study, MoLCs and MoDCs derived adherent monocytes were exposed to multi-PAMP-contact, as found in vivo after the loss of the epidermal barrier function and under direct pathogen-contact. On the level of DC-maturation and secretion of TH1/TH17/TH22-inducing cytokines, like IL 6, IL 1β and IL 23, a synergism of different TLR-ligands was detected. This effect was followed by an upregulation of the secretion of TNF α and IL 22 by cocultured MoLCs and CD4+T-cells. The induction of the IL 17-production in CD4+T-cells did not correlate with the secretion IL 6, IL 1β or IL 23 by MoLCs. After TLR2-stimulation the secretion of the proinflammatory cytokines IL 6, TNF α, IL 12p70, IL 23 and IL 1β was differently regulated in MoDCs and MoLCs. Interestingly MoLCs in contrast to MoDCs lacked the capability to produce IL 12p70. And after stimulation with PGN combined with CD40L the secretion of IL 1β and not IL 12p70 was synergistically influenced in MoLCs, whereas in MoDCs the secretion of IL 12p70 and not IL 1β was synergistically upregulated. Furthermore the cooperative effects of different TLR-agonists under simultaneous stimulation varied in MoDCs and MoLCs. The concurrent stimulation of the TLR4, the interface between TRIF- and MyD88-signalling, with LPS and the TRIF-associated TLR3 with PolyI:C on MoLCs led to the synergistic secretion of IL 6, IL 1β and IL 12p70 and therefore to a synergism, which has not yet been observed in studies on other DC-populations. Similarly we showed for the first time a synergistic effect of the simultaneous stimulation of the TLR2 and the TLR4 in human cells. MoLCs, which were stimulated by TLR2 (PGN) or in particular by the heterodimer TLR2/6 (MALP 2) in combination with TLR4 (LPS), synergistically secreted IL 6, IL 1β and IL 23. In MoDCs the secretion of IL 12p70 and in pDCs the secretion of IL 23 were synergistically upregulated after the simultaneous stimulation of the TLR2 and the TLR4. The heterodimer TLR2/6 seemed to be of critical relevance for the synergistic effect. The combined stimulation of other MyD88-associated TLRs, like the TLR1/2 (Pam3), TLR5 (flagellin) or TLR9 (bacterial DNA), and TLR4 (LPS) did not show any synergism. How the synergisms develop on the level of signal transduction and whether they are influenced by an upregulation of the TLR- expression, has to be investigated in further studies. Besides the synergisms referring to cytokine secretion, the expression of the costimulatory molecules CD40, CD54, CD86, HLA DR and CCR7 was upregulated on the plasma membrane of MoLCs after stimulation with PGN combined with LPS or DNS. In the cocultures LPS or PGN stimulated MoLCs enhanced the IL 17-production by CD4+T-cells. A synergistic effect was shown for the combination of LPS and DNS, which suggests a cell-cell-contact dependent induction of the IL 17-production. IFN γ however was not influenced by combined stimulation. As single stimulus and in combination, LPS led to an upregulation of IL 17+IFN γ+cells, which could represent a mixed TH1/TH17-phenotype. The simultaneous stimulation of the TLR2 and the TLR4 or the TLR2, TLR4 and TLR9 showed synergistic effects on the expansion of the TH22-population and the upregulation of the IL 22-secretion. The IL 22-production correlated with TNF α and the IL 6 secreted by MoLCs, two essential factors of TH22-differentiation. Overall PGN and LPS, two molecules of the bacterial cell wall, showed strong effects on the activation of DCs and the following TH-differentiation and cytokine secretion