Establishment of microarray technology / in-gel analysis for the use in cancer diagnostics

Zusammenfassung 14 Abstract 18 1\. Einleitung 21 1.1 Glykobiologie 21 1.1.1 Definition 21 1.1.2 Geschichte 21 1.1.3 Glykosylierung 22 1.1.4 Zusammensetzung der Glykane 23 1.1.4.1 N-Glykane 25 1.1.4.2 Biosynthese von N-Glykanen 27 1.1.4.3 O-Glykane 31 1.1.4.4 Biosynthese von O-Glykanen 32 1.1.5 IgG Glykosylierung 32 1.2 Funktionen der Glykane 35 1.2.1 Proteinfaltung 35 1.2.2 Erkennung 35 1.2.3 Bei Tumorerkrankung 35 1.2.4 Transport 36 1.2.5 Schutz 36 1.2.6 Andere Mechanismen 36 1.3 Glykosylierung bei Tumorerkrankungen 36 1.4 Biomarker für die Krebsdiagnostik 39 1.4.1 Ovarialkarzinom 39 1.4.2 Kolonkarzinom 41 1.5 Glykananalyse 42 1.6 Glykan-Mikroarrays 47 1.6.1 Immobilisierung 49 1.6.2 Detektion 49 2\. Ergebnisse 51 2.1 Analyse des Glykosylierungsprofils aus Seren von Borderline-Ovarialkarzinom und Ovarialkarzinom- Patientinnen 51 2.1.1 N-Glykananalytik von IgG aus Seren von gesunden, Ovarialkarzinom sowie Borderline Ovarialkarzinom- Patientinnen 52 1.1.1.1 MALDI-TOF-MS Analyse der IgG Glykopeptiden aus Seren von Ovarialkarzinom, Borderline-Ovarialkarzinom und gesunden Kontrollen 52 1.1.1.2 Statistische Auswertung mittels SPSS 55 1.1.2 N-Glykananalytik mittles MALDI- TOF-MS von Ovarialkarzinom-, Borderline-Ovarialkarzinom- Proben sowie gesunden Kontrollen 61 1.1.2.1 Vorbereitung und Analyse der Borderline- Ovarialkarzinom-Proben 61 1.1.2.2 MALDI-TOF-MS Analysen der Ovarialkarzinom sowie Borderline-Ovarialkarzinom Proben 65 2.1.2.3 Hauptkomponenten-Analyse 69 2.1.2.4 Statistische Auswertungen mittels SPSS 70 2.1.2.4.1 Statistisch relevante N-Glykanstrukturen in Borderline-Ovarialkarzinom 70 2.1.2.4.2 MALDI- TOF/TOF-MS-Analyse der in Border- line-Ovarialkarzinom signifikanten N-Glykanstrukturen 76 2.2 Veränderung des Glykosylierungsprofils in Blutseren von Kolonkarzinom-Patienten 80 2.2.1 Analyse des Glykosylierungsprofils aus Seren von Patienten mit Kolonkarzinom und gesunden Kontrollen 81 2.2.2 MALDI- TOF-MS Analyse von gesunden und Kolonkar- zinom-Serumproben 81 2.2.3 Hauptkomponenten-Analyse der MALDI-TOF-MS Spektren 83 2.2.4 Statistische Auswertung mittels SPSS 84 2.2.4.1 Statistisch relevante N-Glykanstrukturen in Kolonkarzinom 84 2.2.4.2 MALDI-TOF/TOF-MS-Analyse der in Kolon- karzinom statistisch wichtigen N-Glykan- strukturen 88 2.2.4.3 GlycoColon-Wert vs. CEA 91 2.3 In-Gel Analyse von Modellproteinen 93 2.3.1 Modellprotein Ribonuklease B 94 2.3.2 Modellprotein Alpha-1-saures-Glykoprotein 95 2.3.3 Modellprotein Fetuin 96 2.4 Glykan-Mikroarrays für die serumbasierte N-Glykananalytik 101 2.4.1 Die Auswahl des passenden Labelreagenzes, Lektins sowie der Oberfläche für die Mikroarray-Analyse 102 2.4.1.1 Synthese und MALDI-TOF-MS Analyse von 2AB markierten Glucoseunits aus Dextranhydrolysat 102 2.4.1.2 Fraktionierungen der gelabelten Dextranhydroly- satproben mittels HPLC 106 2.4.1.3 Monosaccharidanalysen mittels HPAEC-PAD 107 2.4.1.4 Bedrucken der markierten Dextranhydrolysat- proben auf epoxy-aktivierten Glasträgern 108 2.4.2 Isolierung und Aufreinigung von N-Glykanstrukturen für die Mikroarray-Analyse 113 2.4.2.1 Highmannose N-Glykanstrukturen (RNase B) 114 2.4.2.2 Komplexe N-Glykanstrukturen (Fetuin) 118 2.4.2.3 Untersuchungen von Ovarialkarzinom und gesunden Serenproben auf Glykan-Mikroarrays 120 2.4.2.4 Statistische Analyse der Glykan-Mikroarrays 123 3\. Diskussion 126 3.1 Analyse des IgG-Glykoms sowie des N-Glykanprofils aus Seren von Borderline-Ovarialkarzinom und Ovarialkarzinom- Patientinnen 126 3.2 Veränderung des Glykosylierungsprofils in Blutseren von Kolonkarzinom-Patienten 131 3.3 In-Gel-Analyse von Modellproteinen 133 3.4 Glykan-Mikroarrays für die serumbasierte N-Glykan- analytik 135 4\. Material und Methoden 139 4.1 Allgemeine Arbeitsbedingungen 139 4.1.1 Zentrifugen 139 4.1.2 Elektrophorese 139 4.1.3 Sonstige Geräte 139 4.1.4 Chemikalien 140 4.1.5 Enzyme 141 4.1.6 Standards 141 4.1.7 Lösungsmittel 141 4.1.8 Verbrauchsmaterialien 141 4.2 Proben/ Blutserum 142 4.3 Glykananalytische Methoden 142 4.3.1 Reduktion und Carboxymethylierung von Proben 142 4.3.2 PNGase F Verdau 143 4.3.3 Isolierung von Glykopeptiden aus IgG 144 4.3.3.1 Trypsin Verdau 144 4.3.3.2 Aufreinigung mittels Hilic-Säulen aus Baumwolle 145 4.4 Isolierung und Aufreinigung von N-Glykanen 145 4.4.1 C18-Säulen 145 4.4.2 Carbograph-Säulen und selbsthergestellte Graphitspitzen 146 4.4.3 Aufreinigung über Zellulose 147 4.4.4 Entfernung von überschüssigem Labelreagenz mit PDMini TrapTMG10- Säulen 148 4.4.5 Aufreinigung mittels Calbiosorb 149 4.4.6 Aufreinigung mittels der Dialysemembran 149 4.5 Derivatisierung von N-Glykanen 149 4.5.1 Permethylierung 149 4.5.2 Fluoreszenzmarkierung mit 2AB 150 4.5.3 Fluoreszenzmarkierung mit DAP und Rhodamin 110 151 4.6 Proteinbiochemische Methoden 151 4.6.1 SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 151 4.6.2 Probenvorbereitung und Vorbereitung der Gelapparatur 152 4.6.3 Nachweis von Proteinen durch Coomassie-Färbung 153 4.7 Probenvorbereitung für den Vergleich der N-Glykananalyse aus Gelen und Lösungen 153 4.7.1 Abspaltung der N-Glykane in Lösung 153 4.7.2 Abspaltung der N-Glykane In-Gel 154 4.7.2.1 Ausschneiden von Gelspots (Spot Cutting) 154 4.7.2.2 Entfärbung 154 4.7.2.3 In-Gel-Verdau mit PNGase F 154 4.7.2.4 Extraktion 154 4.8 Analytische Methoden 155 4.8.1 MALDI-TOF-MS 155 4.8.2 HPLC Methoden 157 4.8.2.1 HPLC 157 4.8.2.2 Analytische Messung von 2AB markiertem DH mittels TSKgel Amid-80 Säulen 157 4.8.2.3 Messung von 2AB markiertem DH mit der ana- lytischen Luna 3NH2 100A 158 4.8.2.4 Fraktionierungen von 2AB, DAP und Rho-110 markierten Glykanen mittels Luna 5NH2 100A 159 4.8.3 Monosaccharidbestimmung mit HPAEC-PAD 160 4.8.3.1 TFA-Hydrolyse 161 4.9 Analyse mittels Glykan-Mikroarrays 163 4.9.1 Reduktion, Carboxymethylierung und PNGase F Verdau von RNase B mit DTT und IAA 163 4.9.2 PNGase F Verdau 164 4.9.3 Herstellung der Glykan-Mikroarrays 164 4.9.4 Immobilisierung der Glykane 164 4.9.5 Serumproben auf Glykan-Mikroarrays 165 4.9.5 Reinigung und Fluoreszenzanalyse 165 4.10 Verwendete Software 165 5\. Literatur 167 6\. Anhang 179Die rechtzeitige Detektion von Tumorerkrankungen könnte in Zukunft die Möglichkeit erhöhen, Patienten effektiver und schneller zu heilen und so ihre Überlebenschancen zu erhöhen. Bisher gibt es für viele Tumorarten nicht die geeignete Diagnosemethode, um eine frühzeitige und spezifische Diagnose zu gewährleisten. Daher ist der Bedarf groß neue, schnelle sowie spezifische Methoden zu etablieren, mit denen es möglich ist, bereits aus Seren von Tumorpatienten potentielle Biomarker zu entdecken. Es ist auch von entscheidender Bedeutung, Biomarker für die Bestimmung der Art und des Stadiums der Tumorerkrankung zu identifizieren. Die Veränderung der Glykosylierung auf Zelloberflächen während der Entwicklung, Differenzierung und Erkrankung wird zunehmend als potentielle spezifische Biomarkerkandidaten für viele Krebsarten und Entzündungskrankheiten betrachtet. Borderline- Ovarialkarzinom Im Rahmen dieser Arbeit wurde das N-Glykosylierungsmuster von Borderline-Ovarialkarzinom-Patientinnen analysiert um herauszufinden, ob es mögliche Unter-schiede zwischen Ovarial (Ovca)- und Borderline-Ovarialkarzinom (BOT) Patientin-nen gibt. Zuerst wurde das IgG-Glykom unter Verwendung von Trypsin analysiert. Es konnten insgesamt sechs signifikante Glykopeptidstrukturen ermittelt werden, die in Kombination mit dem gängigen Biomarker CA-125 die beste Spezifität sowie Sensi-tivität aufweisen, um OvCa sowie BOT-Serenproben von gesunden Serenproben zu unterscheiden. Mit dieser Kombination war es möglich, alle BOT-Proben als krank zu klassifizieren. Es war aber nicht möglich, zwischen OvCa und BOT zu unterscheiden. Im nächsten Schritt wurde das N-Glykom des gesamten Serums von OvCa- und BOT Patientinnen mit ihren entsprechenden altersangepassten gesunden Kontrollen analysiert und verglichen. N-Glykane wurden selektiv mit dem Enzym PNGase F aus menschlichen Blutseren freigesetzt, isoliert und anschließend mittels MALDI-TOF-MS gemessen. Um alle N-Glykanstrukturen einschließlich diejenigen mit negativ geladenen Sialinsäuren, zu detektieren, wurden sie zuvor mit Methyliodid derivatisiert. Diese Derivatisierungsreaktion ermöglicht eine Messung im positiven Ionisations-modus. Ihre Strukturen wurden mit MALDI-TOF/TOF-MS Fragmentierungs-Analysen bestätigt. Die Arbeitsgruppe hat bereits einen Serum Biomarker namens GLYCOV spezifisch für OvCa entwickelt. Für BOT-Proben wurden auch die GLYCOV-Werte bestimmt. Allerdings war eine Differenzierung zwischen OvCa- und BOT nicht möglich. Ein neuer Wert, GLYCOV_B, wurde aus den statistisch signifikanten Strukturen in BOT etabliert, um diese Kohorte besser zu bestimmen und einzugrenzen. Mit dem neu berechneten Wert wurde keine einzige Probe als gesund eingestuft. Die Haupt-komponentenanalyse bestätigt nochmals, dass beide maligne Kohorten sich voneinander unterscheiden. Eine solche Klassifizierung wurde bisher noch nicht in der Literatur beschrieben. Kolonkarzinom Desweiteren wurde in dieser Arbeit das N-Glykosylierungsprofil aus Seren von Kolonkarzinom (CRC)-Patienten untersucht, um potentielle glykanbasierende Biomarker zu identifizieren. Diese Art von Tumorerkrankung gehört weltweit zu den führenden Todesursachen. Die Überlebenschancen steigen mit der frühzeitigen Erkennung um mehr als 90%. Daher sind robuste Biomarker mit hoher Empfindlichkeit sowie Spezifität sehr hilfreich. Nach der enzymatischen Freisetzung wurden die N-Glykane gereinigt, permethyliert und mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Die signifikanten Strukturen wurden mit MALDI-TOF/TOF-MS bestätigt. In CRC Seren sind zwei monofucosylierte biantennäre Strukturen herunterreguliert, wohingegen zwei difucosylierte, mono- und diantennäre Strukturen und drei sialylierte monofucosylierte Strukturen hochreguliert sind. Aus den sieben bedeutenden Strukturen wurde ein sogenannter GlycoColon-Wert berechnet, der mit CEA, dem aktuellen Biomarker für Darmkrebs, verglichen wurde. Sowohl die Spezifität, als auch die Sensitivität der GlycoColon-Werte waren besser als die vom CEA Biomarker. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Kombination von beiden Biomarkern eine Sensitivität von 92% und eine Spezifität von 96% liefert. In- Gel-Analytik Um eine schnelle und effiziente Methode zur Freistzung und Analyse von geringen Mengen an N-Glykanen zu etablieren, wurde die Detektion von In-Gel verdauten N-Glykanen durch die Zugabe von OGP, einem nichtionischen Detergens und der Nutzung von Anchorchip-Target mit D-Arabinosazon als Matrix verbessert. Es wurden drei verschiedene Modellproteine (RNase B, AGP und Fetuin) in SDS-PAGE-Gelen in Anwesenheit von OGP mit PNGase F verdaut. Mit dieser Optimierung konnte eine Nachweisgrenze von mindestens 10 pmol des Modellproteins bestätigt werden. Die MALDI-TOF-MS-Spektren mit höheren Signlintensitäten bestätigen, eine verbesserte Freisetzung und Extraktion von N-Glykanen aus im Gel verdauten Proteinen durch die Zugabe von OGP. Glykan- Mikroarrays für die serumbasierte N-Glykananalytik Die Mikroarraytechnologie, die eine schnellere und effizientere Analyse ermöglicht, wird zunehmend für neuartige diagnostische Anwendungen eingesetzt. Sie ist auch ein weitverbreitetes Glykomik-Werkzeug geworden, um biologische Fragen zu entschlüsseln. In dieser Studie wurden N-Glykane aus Seren isoliert, gereinigt und anschließend markiert. Die für die Mikroarray-Analyse benötigten optimalen Bedin-gungen wie Labelreagenz, Oberfläche und Bindungsprotokoll, wurden mithilfe von Glucoseoligomeren bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass anstelle des üblichen Labelreagenz 2AB, DAP-Glucoseoligomere viel effizienter an epoxyaktivierten Glasträgern binden. Danach wurden Seren von OvCa- Patientinnen und ihren entsprechenden alters-angepassten gesunden Kontrollen mithilfe von Glykan-Mikroarrays untersucht. Mannosestrukturen und komplexe N-Glykanstrukturen (Hex6HexNAc5Neu5Ac3-2AB (m/z 3764.6) und Hex5HexNAc4Neu5Gc2-2AB (m/z 3014.6)) wurden zuvor durch HPLC-Fraktionierung isoliert und auf epoxyaktivierte Glasträger gedruckt. Nachdem die Glykan- Mikroarrays mit Serum beschichtet wurden, wurde ein zweiter fluores-zierender Antikörper, der gegen Immunglobuline gerichtet war, angewendet. Die resultierenden Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz- scanners gemessen. Die Signalintensitäten von Highmannosen und Hex5HexNAc4-Neu5Gc2-2AB waren auf OvCa-Arrays signifikant stärker als auf den gesunden Arrays. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Anti-Highmannose- und Anti-NeuGc-Autoantikörper potentielle Serum-Biomarker für OvCa sind.Most cancerous tumors are detected at a late-stage because of the lack of suitable diagnostic methods to ensure an early and specific diagnosis. Therefore, there is a crucial need to establish new and rapid method that allows the early detection of neoplasia in the sera of tumor patients, which could offer the possibility to heal them faster and to increase their chances of survival. It is also of high interest to discover potential biomarkers that determine the type and stage of the tumor disease prior to invasive operations. Glycome changes during development, differentiation and disease are increasingly recognized as biomarkers that are specific for many types of diseases such as cancer and inflammatory diseases. Borderline ovarian cancer In this study, the serum N-glycosylation pattern of BOT patients was analyzed to find out, whether it was possible to differentiate between ovarian- and BOT patients at the serum level. At first, the IgG glycome was measured using tryptic glycopeptides, purified from serum using protein A. Six statistically significant glycopeptide structures were detected by MALDI-TOF-MS using SPSS analyses. The best specificity and sensitivity could be achieved with the combination of the common used biomarker CA-125 and the six different structures. With this combination, it was possible to classifiy all BOT samples as ill but it was not possible to distinguish between OvCa and BOT samples. In the next step, the N-glycome of total serum from OvCa, BOT and age-matched healthy controls were analyzed. N-glycans were selectively released with the enzyme PNGase F from human blood sera, isolated and subsequently measured by MALDI-TOF-MS. In order to detect all N-glycan structures including those with negatively charged sialic acid units, N-glycans were previously derivatized with methyl iodide. This derivatization reaction enables a measurement in positive ionization mode of all N-glycan structures. Their structures were confirmed by MALDI-TOF/TOF-MS fragmentation analysis. The working group has already developed a serum biomarker named GLYCOV for OvCa. GLYCOV values were determined for BOT samples but they failed to discriminate BOT from healthy controls. A new value, GLYCOV_B, was calculated from the statistical differences observed between BOT and healthy control samples. With the new calculated value, all BOTsamples were classified as borderline and none of them were classified as healthy. The principal component analysis makes clear that both disease cohorts differ from each other. Such a classification has not been previously described in the literature. Colon cancer Further, the N-glycosylation profile from sera of colon cancer patients was examined to identify potential glycan-based biomarkers. This type of neoplasia is among the world's third leading cause of death. Survival chances increase with early detection by more than 90%. Therefore, robust serum biomarkers with high sensitivity and specificity would be very helpful. After enzymatic release, N-glycans were purified, derivatized via permethylation and measured by MALDI-TOF-MS. Seven statistically significant structures were identified by SPSS analyses and their structures were confirmed by MALDI-TOF/TOF-MS. Two monofucosylated biantennary structures were down-regulated whereas two difucosylated mono- and diantennary structures and three sialylated monofucosylated structures were upregulated. A so-called GlycoColon value was generated from the seven significant structures, which was compared with CEA, the current biomarker for colorectal cancer. Both, specificity and sensitivity of GlycoColon values, were better than of CEA. In addition, when both biomarkers were combined together, the sensitivity reached 92% and the specificity 96%. In-gel N-glycan analysis To establish a rapid and efficient method to release and analyze minute amounts of N-glycans, the detection of in-gel digested N-glycans by MALDI-TOF was improved for model proteins by the addition of OGP, a non-ionic detergent, and by measurements on an Anchorchip target using D-arabinosazone as the matrix. Three different model proteins (RNase B, AGP and Fetuin) were digested in SDS-PAGE gels in the presence or absence of OGP. With this optimization, a limit of detection as low as 10 pmol of the model glycoprotein could be achieved. The addition of OGP enables an improved release and extraction of N-glycans from proteins stacked within the gel as the MALDI-TOF-MS spectra show structures with higher signal intensities. Glycan microarrays for serum-based diagnostics The microarray technology that enables faster and more efficient analysis is increasingly used for establishing novel diagnostic applications. In parallel, it has become a wide¬spread glycomics tool to unravel biological questions. In this study, N-glycans were isolated from human sources and subsequently labeled. The optimum label, surface and binding protocols were selected using glucose oligomers as model substances. It could be shown that, instead of the usual label 2AB, DAP glucose oligomers were binding to the surface of the slide much more efficiently. Thereafter, sera from OvCa patients and age- matched healthy controls were investigated with the microarray technology. High mannose N-glycans and complex-type N-glycanstructures (Hex6HexNAc5Neu5Ac3-2AB (m/z 3764.6) and Hex5Hex-NAc4Neu5Gc2-2AB (m/z 3014.6)) were isolated by HPLC fractionation. Slides were coated with glycans, serum was put on the slides and finally a secondary fluorescent antibody directed against immunoglobulins was applied. The resulting fluorescent signals were measured using a fluorescence scanner. The signal intensities of the high- mannose N-glycans and Hex5HexNAc4Neu5Gc2-2AB were significantly stronger on OvCa arrays than on healthy control arrays. In summary, anti-high-mannose and anti-NeuGc autoantibodies are potential serum biomarkers for OvCa