The structure of the IRES-RNA of Dicistroviruses

Der zentrale Prozess der Realisierung der Erbinformation in Form von Proteinen wird Translation genannt. Sie wird durch auf RNA basierenden, makromolekularen "Maschinen" bewerkstelligt, den Ribosomen. Die Translation wird durch sog. Translationsfaktoren initiiert und kontrolliert. Bei Eukaryonten beinhaltet der Standardmechanismus der Translationsinitiation die Bindung eines ribosomalen Initiationskomplex an die 5'-Capstruktur der mRNA sowie einen Scanning-Mechanismus, bei dem sich der ribosomale Initiationskomplex entlang der mRNA zum ersten Startkodon bewegt. Danach kommt es zur Anlagerung der großen ribosomalen Untereinheit und die Translation des Proteins beginnt. Zusätzlich zu diesem konventionellen Weg der Translationsinitiation gibt es einen alternativen Weg. Nicht die 5’ Cap-Struktur wird erkannt, sondern ein strukturelles Element in der 5'-untranslatierten Region der mRNA. Diese Elemente werden IRES (engl., "internal ribosomal entry sites") genannt. Bei ihnen wird zwischen verschiedenen Familien unterschieden, die je nach Art eine interne Translationsinitation unter teilweiser oder vollständiger Umgehung des konventionellen Mechanismus ermöglichen. Die IRES-RNA scheint dabei die Funktion von RNA-basierenden Translationsfaktoren zu übernehmen. Über den molekularen Aufbau der IRES-Elemente, die diese Funktion ermöglichen, ist bisher wenig bekannt. IRES zeigen eine große Bandbreite verschiedener Strukturen, bei denen jedoch bestimmte statische und flexible Elemente für die verschiedenen Funktionen verantwortlich sind. Eine besondere IRES ist die des cricket paralysis virus (CrPV). Es besitzt die ungewöhnliche Eigenschaft, die Initiation ohne weitere Initiationsfaktoren oder Initiator-tRNA durchzuführen zu können. Die hier ermittelte Information über dessen Struktur auch für die Untersuchung und das Verständnis der IRES-kontrollierten Translationsinitiation im Allgemeinen genutzt werden. Zur Ermittlung der CrPV- IRES-Struktur wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene ribosomale Komplexe hergestellt und mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelrekonstruktion untersucht. Durch umfangreiche Verbesserungen im Bereich der Probenpräparation sowie der Datenverarbeitung war es möglich, die Struktur ribosomal gebundener IRES mit einer Auflösung von 7,3Å zu ermitteln. Diese Auflösung erlaubte erstmals die de novo Modellierung der vollständigen CrPV-IRES-RNA mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie. Das Modell erlaubte sowohl die Zuordnung der verschiedenen zur Translationsinitiation notwendigen Funktionen zu den IRES-Strukturelementen als auch die molekulare Interpretation der Interaktionen der IRES mit den ribosomalen Komponenten an den tRNA-Bindungsstellen A , P- und E. Mit dieser Arbeit konnte eine strukturelle Grundlage für das Verständnis der IRES-kontrollierten Translationsinitiation erarbeitet werden. Diese Kenntnisse können genutzt werden, um z.B. speziell gegen diesen Mechanismus gerichtete Medikamente zu entwickeln und so wirksame antivirale Therapien zu ermöglichen. Die zur Aufklärung der Struktur entwickelten Techniken eröffnen den Weg zur Untersuchung einer größeren Anzahl biologisch relevanter Komplexe, die mit bisherigen Untersuchungsmethoden wie z.B. der Röntgenstrukturanalyse nicht zugänglich waren.The central process of realizing the genetic information of proteins is called translation. It is executed by ribosomes, RNA based, macromolecular "machines". The translation is initiated and controlled by translation factors. The standard mechanism of eukaryotic translation initation includes the binding of a ribosomal initiation-complex to the 5'-cap-structure of the mRNA and a scanning mechanism, in which the ribosomal initiation complex is moving to the first start-codon. After these events the large ribosomal subunit joins the complex and translation of proteins can occure. In addition to this canonical way of translation initiation an alternative pathway exists. It is driven by by IRES ("internal ribosomal entry sites"), a structural element at the 5'-untranslated region from the RNA. There are three different IRES families, which allow the internal translation initiation among partially or complete bypassing of the canonical mechanism. It seems that the IRES-RNA assumes the function of an RNA-based translation factor. The molecular structure which allows this function is mostly unknown. IRES elements show a wide band of different structures, in which different static or flexible elements are responsible for different functions. A special form is the IRES of cricket paralysis virus (CrPV). It has the uncommon ability to perform the initiation without initiation factors or initiator tRNA. Therefore the ascertained information about its structure can also be used for the examination and understanding of the IRES-based translation in general. To determine the structure of the CrPV-IRES, different ribosomal complexes were assembled during this study which has been analysed by cryo-electronmicroscopy and single particel reconstruction. As a result, it was possible to determine the structure of the ribosome-bound IRES at a 7,3Å resolution. This resolution allows for the first time ever both the de novo modelling of the complete CrPV-IRES-RNA and by cryo-electronmicroscopy. This model allows the allocation of the different structural elements involved in translation initiation as well as the interpretation of the interactions between IRES and ribosomes at A-, P-and E-tRNA-binding sites. This study achieved a structural base for the understanding of how IRES-based translation initiation could be acquired. This knowledge can be used to affect this mechanism by pharmaceuticals to develop effective antiviral treatments. The developed technics used to determine the structure will open the way to analyse a huge number of biological components which are difficult to access by Xray-crystallography