Experiences with the vaccination of laying hens in alternative husbandry with different inactivated E. coli vaccines under field conditions

Deckblatt-Impressum persönlicher Dank Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Einleitung Literaturübersicht Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Schlussfolgerungen Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Danksagung SelbständigkeitserklärungDurch E. coli hervorgerufene Erkrankungen zählen zu den häufigen Ursachen für erhöhte Mortalitätsraten in der alternativen Legehennenhaltung. Aufgrund der ausgesprochen begrenzten therapeutischen Möglichkeiten bei Legehennen sind prophylaktische Maßnahmen beispielsweise in Form von Impfungen von großer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene bestandsspezifische E. coli-Inaktivat-Impfstoffe sowie ein für Mastelterntiere zugelassener E. coli- Impfstoff bei 7.196 Legehennen im alternativen Haltungssystem geprüft. Die Legehennen waren in 4 Versuchsgruppen und eine ungeimpfte Kontrollgruppe unterteilt und sowohl während der Aufzucht als auch der Legeperiode gleichen Bedingungen jeweils im gleichen Stall ausgesetzt. Die für die bestandsspezifischen Vakzine verwendeten Stämme wurden aus an Kolibakteriose verendeten Legehennen isoliert, serotypisiert und mittels PCR auf das Vorhandensein 7 APEC spezifischer, virulenzassozierter Gene (astA, irp-2, fyua, iucD, tsh, fim C, pap C) untersucht. Letztendlich wählte man nach dem Pathogenitätstest im embryonierten Hühnerei 3 von 25 isolierten E. coli- Stämmen für die Impfstoffherstellung aus, wovon 2 Isolate der O-Gruppe O1 und ein Isolat der O-Gruppe O18 zuzuordnen waren. Sie verfügten über 5, 6 bzw. 7 der virulenzassoziierten Gene. Daraus wurden 2 Impfstoffe hergestellt, die alle 3 Stämme enthielten, sich aber in ihrem Keimgehalt (10(hoch8) bzw. 10(hoch9) KbE pro ml) unterschieden. Diese wurden den Tieren ein- bzw. zweimal während der Aufzucht s.c. appliziert. Die Erfolgskontrolle der zu prüfenden Impfstoffe erfolgte anhand der klinischen Untersuchung der Tiere, der Mortalitätsrate, durch pathologisch-anatomische und bakteriologische sowie serologische Untersuchungen, die mittels selbst hergestelltem indirekten ELISA-Testsystem durchgeführt wurden. Klinisch konnten zu keiner Zeit Abweichungen von dem für das Alter zu erwartenden Gesundheits- und Allgemeinzustand der Tiere beobachtet werden. Die Mortalität während der Legeperiode lag im Mittel bei 7,38 %, wobei die Werte zwischen 6,54 % (ungeimpften Kontrollgruppe) und 8,35 % (einmalige Impfung mit 0,5 ml x 10(hoch9) KbE/ml in der 12. LW) schwankten. Während des gesamten Untersuchungszeitraumes konnten keine Unterschiede zwischen den geimpften Gruppen und der ungeimpften Kontrollgruppe hinsichtlich der klinischen Erscheinungen sowie die Mortalität festgestellt werden. Bakteriologisch ließen sich 36 E. coli-Stämme isolieren, wovon 21 serotypisiert und auf virulenzassoziierte Gene untersucht wurden. Während über die Serotypisierung lediglich 4 (19,0 %) E. coli-Isolate dem Serotyp O2 zugeordnet werden konnten, war mit Hilfe des molekularbiologischen Nachweisverfahrens in allen untersuchten E. coli-Stämmen mindestens ein APEC-spezifisches, virulenzassoziiertes Gen [(iss (95,2 %), iucD (52,4 %), irp2 (33,3 %), astA (33,3 %), tsh (23,8 %), papC (4,8 %)] zu detektieren. Insbesondere die hohe Prävalenz des nicht über den Impfstoff abgedeckten Anti-Wirtsabwehrsystems Iss (incresaed serum survival; iss: 95,2%) deutet auf dessen wichtige Rolle in der Pathogenese der Kolibakteriose hin. Die serologische Verlaufsuntersuchung ergab einen Anstieg der Serumtiter bis zur 19. LW, wobei der Vergleich der Mittelwerte aus den Messwerten der 12. und 16. LW der Impfgruppen untereinander (Mehrfachvergleiche-Scheffé-Prozedur), einen signifikanten Unterschied (P ≤ 0,05) im Anstieg der Titer zwischen der doppelt geimpften Versuchsgruppe (2 x 0,5 ml x 10(hoch9) KbE/ml) und der ungeimpften Kontrollgruppe ergab. Mit der 20. LW beginnend fiel der Antikörperspiegel stetig ab und wies in der 50. LW seinen niedrigsten gemessenen Wert in der Legeperiode auf. Für die diagnostische serologische Untersuchung von Hühnerseren wurde die Spezifität des verwendeten indirekten ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen E. coli nachgewiesen und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse durch die Intra- und Interassay-Differenzen belegt. Zum Ende der Legeperiode erfolgte ein Belastungstest bei je 50 Tieren pro Gruppe. Dazu verabreichte man je 25 Tieren pro Gruppe intratracheal 0,5 ml einer keimhaltigen Tryptose-Phosphat-Bouillon (10(hoch7) KbE bzw. 10(hoch8) KbE). Die belasteten Tiere wurden beobachtet und der zeitliche Verlauf ihrer Mortalität dokumentiert. Die Ergebnisse des Belastungstests zeigten, daß die Gruppen mit der höheren Challenge-Dosis unabhängig von der Versuchsgruppe auch die höheren Verlustraten aufwiesen. Bei der höheren Infektionsdosis lagen sie zwischen 68-80 %, bei der niedrigen Infektionsdosis zwischen 48 und 68 %. Von einem Einfluss der E. coli-Impfung auf den Verlauf der Mortalität bzw. einem Impfschutz bis zum Nutzungsende der Legehennen, kann also nicht ausgegangen werden. Im Ergebnis dieser Arbeit war kein messbarer Einfluss der E. coli- Impfung auf die Entwicklung produktionsrelevanter Parameter, wie beispielsweise die Mortaliltät der Legehennen in und zwischen den Versuchsgruppen zu verzeichnen. Nimmt man jedoch, wie unter Praxisbedingungen üblich, die Bestandsgesundheit als Grundlage der Erfolgskontrolle, zeichnet sich durch die Entwicklung der Gesamtmortalität (7,38 %) im Vergleich zu den Vorherden (25-30 %) ein deutlich positiver Trend ab. Allerdings kann der Einsatz von bestandsspezifischen E. coli-Impfstoffen nur dann ein Erfolg versprechendes Mittel zur Kontrolle von APEC-Infektionen sein, wenn im Vorfeld ausreichende Untersuchungen zur Erregeridentifizierung, insbesondere den vorhandenen Virulenzfaktoren, erfolgt sind. Unerlässlich für eine effiziente Prophylaxe ist jedoch nicht nur die ordnungsgemäße Applikation einer wirksamen E. coli-Vakzine, sondern in jedem Fall die Optimierung aller Managementparameter (Haltung, Fütterung und Biosecurity).Diseases caused by E. coli are numbered among the most frequent causes of increased mortality rates in the alternative husbandry of laying hens. Due to the very limited therapeutic possibilities for laying hens, prophylactic measures such as vaccinations are of great significance. Within the framework of this study, various population-specific inactivated E. coli vaccines were tested on 7.196 laying hens living in alternative husbandry systems. The laying hens were divided into four test groups and one unvaccinated control group, and stayed, for both the breeding and the laying period, under equal conditions in the same coop. The strains used for the population-specific vaccines were isolated from laying hens which had died from colibacteriosis, then serotyped and with the aid of PCR checked for the presence of 7 APEC specific, virulence associated genes (astA, irp-2, fyua, iucD, tsh, fim C, pap C). After carrying out a pathogenicity test, we eventually selected 3 out of 25 isolated E. coli strains in the embryonated egg for the vaccine production, two of them being isolates of the O-group O1 and one of them an isolate of the O-group O18. They showed 5, 6 or 7 of the virulence associated genes. Two vaccines were produced from it which contained all three strains, but differed in their amount of germs (10(hoch8) resp. 10(hoch9) KbE per ml). These vaccines were subcutaneously administered to the animals on one or two occations during their breeding. The measurement of results of the examined vaccines was carried out based on the clinic examination of the animals, on the mortality rate and pathological-anatomical examinations as well as on bacteriological and serological tests which were performed using the indirect ELISA test system developed by ourselves. Clinically, there were no variations from the state of health and the general condition to be expected for animals of that age. The mortality rate during the laying period averaged at 7.38 %, while the values ranged from 6.54 % (unvaccinated control group) to 8.35 % (one vaccination with 0.5 ml x 10(hoch9) KbE/ml during the 12th laying week). In the course of the whole study, we could not determine any differences between the vaccinated groups and the unvaccinated control group regarding the clinical parameters and the mortality. Bacteriologically, 36 strains of E. coli could be isolated, 21 of which were serotyped and tested for virulence associated genes. While there were only 4 (19.0 %) E. coli isolates that could be allocated to serotype O2 through serotyping, we were able to detect at least one APEC specific, virulence associated gene [(iss (95,2 %), iucD (52,4 %), irp2 (33,3 %), astA (33,3 %), tsh (23,8 %), papC (4,8 %)] in all tested E. coli strains using the molecular biological detection method. In particular the high prevalence of the anti-host defence system Iss (incresaed serum survival; iss: 95,2%) not covered by the vaccine points out its key role in the pathogenesis of colibacteriosis. The serological progression study showed an increase of the serum titer until the 19th laying week (LW), whereas the comparison of the mean values from the vaccine groups measurement readings of the 12th and 16th LW (Scheffe s procedure within the multicomparison testing) presented a significant difference (P ≤ 0.05) of the increase of titers between the group of two vaccinations (2 x 0.5 ml x 10(hoch9) KbE/ml) and the unvaccinated control group. From the 20th LW onwards, the antibody level began to fall steadily and in the 50th LW, it showed its lowest value of the whole laying period. For the diagnostic serological test of hen serums, we demonstrated the specifity of the applied indirect ELISA for the detection of antibodies against E. coli and proved the repeatability of the results with intra- and interassay differences. Towards the end of the laying period, a load test was conducted on 50 animals per group. For this purpose, 25 animals per group were intratracheally administered 0.5 ml of a germ-containing Tryptose Phosphate Broth (10(hoch7) KbE resp. 10(hoch8) KbE). The strained animals were observed and the time sequence of their mortality documented. The results of this test indicated that groups with a higher challenge dose also showed higher mortality rates regardless of the respective test group. The mortality rate of the groups with the higher infection dose ranged between 68-80 %, while the lower infection dose ranged between 48 and 68 %. Therefore, we cannot assume that the E. coli vaccination has an effect on the course of mortality or that there is an immunization until the end of the laying period of the hens. As a conclusion of this study, there was no measurable effect of the E. coli vaccination on the development of productive relevant parameters such as the mortality of laying hens within one group and between the test groups. If we take, according to the usual practice, the health of the hen population as a basis for the control of success, there is a definitely positive tendency throughout the development of the overall mortality (7.38 %) compared to the rate of previous herds (25-30 %). However, the employment of population-specific E. coli vaccines can only be a promising remedy for controlling APEC infections if sufficient pathogen identification tests, especially of the present virulence factors, are conducted beforehand. For an efficient prophylaxis, it is not only indispensable to ensure proper application of effective E. coli vaccines, but also to optimize all management parameters (husbandry, feeding and biosecurity)