Molecular mechanisms of immune evasion by the cytomegalovirus-encoded chemokine receptor US28

Titel und Inhaltsverzeichnis Abkürzungen 1 1\. Einleitung 5 2\. Material 21 3\. Methoden 35 4\. Ergebnisse 65 5\. Diskussion 101 6\. Zusammenfassung 123 Summary 125 7\. Literaturverzeichnis 127 Danksagung Erklärung und PublikationDas Genom des ubiquitären humanen Zytomegalievirus kodiert mit US27, US28, UL33 und UL78 für vier G-Protein gekoppelte Rezeptoren mit Sequenzhomologie zu humanen Chemokinrezeptoren. US28 ist der einzige funktionelle Rezeptor für die inflammatorischen, humanen Chemokine RANTES (CCL5), MIP-1alpha (CCL3), MIP- 1beta (CCL4), MCP-1 (CCL2) und MCP-3 (CCL7) und vermittelt die Liganden- abhängige Aktivierung der Mitogen aktivierten Proteinkinase (MAPK) ERK2, die Erhöhung zytoplasmatischer Calciumkonzentrationen und die Chemotaxis glatter Muskelzellen. Daneben induziert die US28-Expression die konstitutive Aktivierung von Phospholipase C und der Transkriptionsfaktoren NF-kappaB und CREB. Die US28-abhängige Entfernung von Chemokinen aus der Umgebung infizierter Zellen wurde als Mechanismus zur Abwehr der menschlichen Immunantwort gedeutet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die gegenwärtig einzigen US28-spezifischen monoklonalen Antikörper hergestellt. Sie erlaubten die Charakterisierung von US28 als late Protein, da es in der späten Phase der Virusreplikation 24-48 Stunden nach einer Infektion primärer humaner Fibroblasten mit dem humanen Zytomegalievirus exprimiert wurde. Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper wurden posttranslationale Modifikationen des US28-Moleküls untersucht. In transient transfizierten HEK293A Zellen unterlag der US28-Rezeptor einer starken Liganden-unabhängigen Phosphorylierung, wurde jedoch nicht durch N-Glykosylierungen oder Tyrosinsulfatierungen modifiziert. Überexpressionsexperimente zeigten, daß US28 ein Substrat der G-Protein gekoppelten Rezeptorkinase 2 war. Zudem waren die Proteinkinase C und die Caseinkinase 2 an der Regulation der konstitutiven US28-Phosphorylierung in HEK293A Zellen beteiligt. Die Analyse der Phosphoaminosäuren ergab für den unstimulierten und den RANTES-stimulierten US28-Rezeptor eine vorwiegende Phosphorylierung an Serinresten und eine geringe Threoninphosphorylierung. Durch Untersuchungen von Rezeptorvarianten, deren carboxyterminale Serin- und Threoninreste durch Alaninreste ersetzt wurden, konnten Serinreste zwischen Position 323 und 350 als Akzeptorstellen der Phosphorylierung identifiziert werden. Weder die konstitutive Aktivierung von NF-kappaB, noch die RANTES- induzierte Aktivierung der MAPK waren von der Rezeptorphos-phorylierung abhängig. Allerdings war die MAPK-Aktivierung bei dem US28 Wildtyprezeptor durch Pertussistoxin hemmbar, bei der nicht phosphorylierten Rezeptorvariante jedoch unempfindlich gegenüber Pertussistoxin, was die Notwendigkeit der US28-Phosphoprylierung für die Kopplung an Proteine der Galpha(i)-Familie andeutet. Zusätzlich zu der beschriebenen ERK2-Aktivierung führte die Stimulation des US28-Rezeptors mit RANTES zu einer Aktivierung der ERK1- und p38-MAPK. Durchflußzytometrische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen mit den US28-spezifischen Antikörpern zeigten eine geringe Expression des US28-Rezeptors an der Oberfläche transfizierter HEK293A, COS-7 und HeLa Zellen. Gleichzeitig konnte die Ansammlung des Rezeptors in intrazellulären Vesikeln nachgewiesen werden. Der Austausch der Phosphorylierungsstellen führte zu einer verstärkten Lokalisation des Rezeptors an der Zelloberfläche und war zudem für eine stark verlangsamte und reduzierte Endozytose des US28-Rezeptors verantwortlich. Somit reguliert die bisher einzigartige konstitutive Phosphorylierung eines G-Protein gekoppelten Rezeptors sowohl die Zelloberflächenexpression als auch die Endozytose des US28-Moleküls. Da die Rezeptorendozytose die mechanistische Grundlage der Ligandeninternalisierung darstellt, kann angenommen werden, daß die Phosphorylierung des US28-Rezeptors eine wichtige strukturelle Voraussetzung für die Beseitigung inflammatorischer Chemokine aus der Umgebung virusinfizierter Zellen darstellt.The ubiquitous human cytomegalovirus encodes four putative G-protein coupled receptors with sequence homology to human chemokine receptors: US27, US28, UL33 and UL78. To date, only the US28 gene product has been characterized as a functional receptor for the inflammatory chemokines RANTES (CCL5), MIP-1alpha (CCL3), MIP-1beta (CCL4), MCP-1 (CCL2) and MCP-3 (CCL7). Upon ligand binding US28 mediates the elevation of intracellular calcium levels, the activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK2 and the chemotaxis of arterial smooth muscle cells. Additionally, transient expression of US28 results in constitutive activation of phospholipase C and the transcription factors NF- kappaB and CREB. It was suggested that the US28 dependent sequestration of chemokines from the environment of infected cells may represent a viral strategy to evade the human immune response. The present study describes the generation of the first US28 specific monoclonal antibodies. They allowed the characterization of US28 as a "late protein" which is expressed during the late phase of viral replication 24-48 hours after infection of human embryonal fibroblasts with human cytomegalovirus. By using the monoclonal antibodies posttranslational modifications of the US28 molecule were analysed. It was shown that US28 undergoes strong ligand-independent phosphorylation but was not modified by N-linked glycosylations or tyrosine sulfation in transiently transfected HEK293A cells. Coexpression experiments characterized the US28 receptor as a substrate for G-protein coupled receptor kinase 2. Moreover, protein kinase C and casein kinase 2 were partially involved in the regulation of constitutive US28 phosphorylation levels in HEK293A cells. Phosphoamino acid analysis revealed a predominant phosphorylation at serine residues and a minor phosphorylation at threonine residues for both the unstimulated and the RANTES-stimulated US28 receptor. Site-directed mutagenesis of C-terminal serine and threonine residues identified serine residues between positions 323 and 350 as major sites of US28 phosphorylation. Signaling studies using the US28 substitution mutants demonstrated that constitutive activation of NF- kappaB and RANTES-induced activation of MAPK were independent from receptor phosphorylation. However, MAPK activation by the US28 wildtype receptor was inhibited by pertussis toxin, whereas phosphorylation deficient receptor mutants remained pertussis toxin insensitive, indicating that receptor phosphorylation is required for coupling to Galpha(i)-proteins. Additionally, it was shown that stimulation of US28 with RANTES induced an activation of the MAPK ERK1 and p38. Flow cytometry and immuno-cytochemistry analysis employing the US28-specific antibodies revealed that US28 accumulated in intracellular vesicles of transiently transfected HEK293A, HeLa and COS-7 cells. Only a minor portion of the receptor was detectable on the surface of US28 expressing cells. Substitution of the phosphorylation sites resulted in an enhanced cell surface expression of US28 and was responsible for a delayed and strongly reduced receptor endocytosis. Thus, constitutive US28 phosphorylation regulates endocytosis and cell surface display of the receptor. Since receptor endocytosis represents a cellular mechanism for ligand internalization constitutive US28 phosphorylation may provide the structural prerequisite for the sequestration of inflammatory chemokines from the environment of infected cells