Biophysical characterisation of oligomers of recombinant prion protein

0 Titelblatt, Inhalt, Abbildungs- u. Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Das Prionprotein 1 1.2 Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie 12 1.3 Zielsetzung 31 2 Material und Methoden 35 2.1 Proteinsynthese und -reinigung 35 2.2 Darstellung von reinem SHaPrP90 232-Oligomer 43 2.3 FTIR-Spektroskopie 45 2.4 MALDI-TOF-Massenspektrometrie 56 2.5 Lichtstreuung 57 2.6 Elektronenmikroskopie 58 2.7 Rasterkraftmikroskopie 58 2.8 FRET-Spektroskopie 58 2.9 Rekonstituierte planare Membranen 59 2.10 Zellkulturexperimente 64 2.11 NMR-Spektroskopie 64 3 Ergebnisse 67 3.1 Charakterisierung der rekombinanten Prionproteine 67 3.2 Das kritische Oligomer des SHaPrP90 232 72 3.3 Weitere Umfaltungs- und Aggregationsbedingungen 90 3.4 Wechselwirkungen von SHaPrP90 232 mit Membranen 101 4 Diskussion 107 4.1 Überblick 107 4.2 Rekombinantes Prionprotein als Modell für die Faltung des PrPC 108 4.3 Stopped-Flow-FTIR-Spektroskopie 111 4.4 Das kritische Oligomer des SHaPrP90 232 115 4.5 Temperaturinduzierte Denaturierung/Aggregation 130 4.6 Wechselwirkung des SHaPrP90 232 mit Membranen 131 4.7 Ausblick 134 5 Zusammenfassung 139 6 Abstract 143 Literaturverzeichnis 147 Abkürzungen 159 Publikationen 163 Danksagung 165 Lebenslauf 167Das Prionprotein repräsentiert der Nur-Protein-Hypothese folgend den alleinigen Erreger der sog. Prionkrankheiten, einer Gruppe von übertragbaren neurodegenerativen Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren. Die krankheitsauslösende Eigenschaft erhält das Prionprotein durch Umwandlung seiner apathogenen zellulären Form PrPC in die pathogene Scrapie-Form PrPSc. Diese Umwandlung geht u. a. mit einer Änderung der vorwiegend durch α-Helices dominierten Sekundärstruktur in eine überwiegend von β-Faltblättern beherrschte Struktur (α->β-Umfaltung) sowie einer damit verbundenen Aggregation des Proteins einher. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden diese α->β-Umfaltung und diese Aggregation am Modell des rekombinanten Prionproteins des Hamsters SHaPrP90 232 mit mehreren unabhängigen Methoden unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Der methodische Schwerpunkt lag dabei auf der zeitaufgelösten Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR- Spektroskopie). Die monomere α-helikale Isoform des SHaPrP90 232 konnte unter geeigneten Bedingungen in eine β-Faltblatt-reiche oligomere Isoform überführt werden. Die während der α->β-Umfaltung abnehmenden α-helikalen Anteile der Sekundärstruktur spiegelten sich in IR-Differenzbanden bei 1 653 cm 1 (Amid-I-Bereich) und 1 551 cm 1 (Amid-II-Bereich) wider, während die entstehenden β-Faltblatt-Strukturen Differenzbanden bei 1 691 und 1 621 cm 1 (Amid-I-Bereich) sowie bei 1 529 cm 1 (Amid-II-Bereich) hervorriefen. Die Lage der Amid-I-β-Faltblatt-Banden ist charakteristisch für intermolekulare und antiparallele β-Faltblatt-Strukturen mit starken Wasserstoffbrückenbindungen. Der Verlust an α-helikaler Sekundärstruktur und die Bildung von β-Faltblatt- Struktur fanden gleichzeitig statt, ohne dass eine ungefaltete intermediäre Isoform identifiziert werden konnte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass innerhalb der experimentellen Totzeit von 250 ms kein β-Faltblatt gebildet wurde. Der parallel zur α->β-Umfaltung erfolgte Aggregationsprozess des SHaPrP90 232 wurde mittels Lichtstreuung zeitaufgelöst untersucht. Dabei zeigte sich, dass das monomere Protein über ein transient stabiles Oligomer das sog. kritische Oligomer zu Protofibrillen aggregierte. Die für die Bildung des kritischen Oligomers benötigte Zeit war ebenso wie dessen Größe von der Proteinkonzentration abhängig. Es wurde eine minimale Größe des kritischen Oligomers von 8 Monomereinheiten bestimmt. Mittels Elektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie wurde das kritische Oligomer morphologisch charakterisiert. Es konnten sowohl kompakte als auch ringförmige Oligomere mit einem Durchmesser von 10 15 nm identifiziert werden, deren Höhe rund einem Viertel ihrer lateralen Ausdehnung entsprach. Kritische Oligomere des SHaPrP90 232 wurden rein dargestellt und durch geeignete Pufferbedingungen stabilisiert; ihre Stabilität wurde mittels MALDI-TOF- Massenspektrometrie überprüft. Die Wechselwirkungen zwischen dem SHaPrP90 232 in seiner monomeren und seiner oligomeren Form mit Modellmembranen wurden mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Spektroskopie und Experimenten an rekonstituierten planaren Membranen vergleichend untersucht. Es wurden deutliche Interaktionen beider SHaPrP90 232-Isoformen mit Membranen, die aus dem negativ geladenen Phosphatidylserin aufgebaut waren, beobachtet. Keine Interaktionen konnten hingegen mit Membranen, die aus dem neutralen Phosphatidylcholin aufgebaut waren, festgestellt werden. Das kritische Oligomer zeigte dabei in Abhängigkeit des pH-Werts im Vergleich zum Monomer ähnlich starke oder schwächere Wechselwirkungen mit den untersuchten Membranen. Weder das kritische Oligomer noch das monomere SHaPrP90 232 konnten Poren in den untersuchten Membranen bilden. Negativ geladene Membranen wurden jedoch durch beide Isoformen des Proteins signifikant destabilisiert. Um die Bildung der kritischen Oligomere von der Entstehung temperaturinduzierter Aggregate des SHaPrP90 232 abgrenzen zu können, wurde die thermische Denaturierung des Proteins FTIR-spektroskopisch untersucht. Die durch Inkubation oberhalb der Denaturierungstemperatur entstandenen β-Faltblatt- Strukturen riefen Absorptionsbanden hervor, die von denen der kritischen Oligomere klar unterschieden werden konnten. So zeigten die bei der thermischen Denaturierung beobachteten β-Faltblatt-spezifischen Amid-I-Differenzbanden bei 1 690 und 1 624 cm 1 zwar auch eine antiparallele, intermolekulare β-Faltblatt-Struktur an, doch waren deren Wasserstoffbrücken deutlich schwächer als die des β-Faltblatts in den kritischen Oligomeren. Um hochaufgelöste Informationen zur Struktur der kritischen Oligomere zu gewinnen, wurde vollständig mit dem Kohlenstoffisotop 13C und dem Stickstoffisotop 15N markiertes 13C-15N-SHaPrP90 232 hergestellt, zu Oligomeren umgesetzt und ersten NMR-spektroskopischen Experimenten unterzogen. In den NMR-Spektren der kritischen Oligomere konnten nach vorläufiger Auswertung hauptsächlich Signale von Aminosäuren aus dem flexiblen N-terminalen Bereich des Proteins detektiert werden. Demgegenüber konnten praktisch keine Signale von Aminosäuren aus strukturell geordneten Abschnitten beobachtet werden. Durch weitergehende Auswertung der bislang gewonnenen Daten sollten aber sequenzspezifische Strukturinformationen zugänglich sein, anhand deren sich in naher Zukunft durch Kombination mit den FTIR-Daten dieser Arbeit erstmals ein Strukturmodell für die kritischen Oligomere des Prionproteins entwickeln ließe.According to the protein-only hypothesis, the prion protein represents the sole infectious agent of so-called prion diseases, which are a group of transmissible neurodegenerative diseases in both humans and animals. The prion protein gains its disease-causing function by conversion of its apathogenic cellular form PrPC into the pathogenic scrapie form PrPSc. This conversion causes a change of the predominantly α-helical secondary structure into a structure dominated by β-sheets (α->β refolding) and thereby leads to an aggregation of the protein. Within the scope of the work at hand, this α->β refolding and aggregation were studied using several independent methods under a variety of conditions with recombinant Syrian hamster prion protein (SHaPrP90 232) as a model. Methodical emphasize was placed on time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR spectroscopy). Under appropriate conditions, the monomeric α-helical isoform of SHaPrP90 232 was transformed into a β-sheet rich oligomeric isoform. The loss of α-helical parts of the secondary structure during α->β refolding was represented by IR difference bands at 1 653 cm 1 (amide I region) and 1 551 cm 1 (amide II region), whereas the formation of β-sheets was indicated by difference bands at 1 691 and 1 621 cm 1 (amide I region) and at 1 529 cm 1 (amide II region). The position of the amide I β-sheet difference band is characteristic for intermolecular and antiparallel β-sheet structures with strong hydrogen bonds. The loss of α-helical secondary structure and the formation of β-sheets occurred concomitantly; an unfolded intermediate state has not been observed. Furthermore, it could be shown that no β-sheet was formed within the experimental dead time of 250 ms. The aggregation process of SHaPrP90 232, which paralleled the α->β refolding, was investigated by time-resolved light scattering. Thereby, it was observed that monomeric protein aggregated to protofibrils via a transient stable oligomer: the so-called critical oligomer. Both the time required for formation of the critical oligomer and its size were dependent on protein concentration. The minimal size of the critical oligomer was assigned to 8 monomer units. By electron microscopy and atomic force microscopy the critical oligomer was morphologically characterised. Both compact and annular shaped oligomers were identified. Their diameter was 10 15 nm with their height being only a quarter of their width. Pure critical oligomers of SHaPrP90 232 were produced and stabilised by appropriate buffer conditions; their stability was checked by MALDI-TOF mass spectrometry. Interactions between SHaPrP90 232 in its monomeric and in its oligomeric form with model membranes were comparatively investigated by fluorescence resonance energy transfer spectroscopy and by experiments with reconstituted planar membranes. Significant interactions of both isoforms with membranes constituted of negatively charged phosphatidylserine could be observed. No interactions, however, were detected with membranes constituted of neutral phophatidylcholine. Compared to the monomer, the critical oligomer showed depending on pH equally strong or weaker interactions with the examined membranes. Neither the critical oligomer nor the monomeric SHaPrP90 232 were able to form pores within the examined membranes. However, negatively charged membranes were significantly destabilised by both isoforms of the protein. To distinguish between formation of critical oligomers and creation of temperature induced aggregates of SHaPrP90 232, thermal denaturation of the protein was investigated by FTIR spectroscopy. The β-sheet structures formed by incubation above the denaturation temperature evoked absorption bands that could be clearly distinguished from those of the critical oligomers: Although also the β-sheet specific amide I difference bands at 1 690 and at 1 624 cm 1, observed during thermal denaturation, were indicative for antiparallel intermolecular β-sheet structure, the hydrogen bonds of this structure were clearly weaker than those of the β-sheets of critical oligomers. To gain high resolution information on the structure of critical oligomers, 13C-15N- SHaPrP90 232 completely labelled with the carbon isotope 13C and the nitrogen isotope 15N was produced, transformed into critical oligomers and used for initial experiments by NMR spectroscopy. After primary evaluation of the data, mainly signals from the flexible N-terminal region of the protein could be observed in the NMR spectra of critical oligomers. Contrary, almost no signals from amino acids lying in structured parts of the protein could be observed. After further evaluation of the data, more sequence specific structural information should be available, on the basis of which it should soon be possible to develop in combination with the FTIR data of this work a structural model of the critical oligomers of the prion protein