Hereditary microcephalies: characterization of the pathomechanism of autosomal recessive primary microcephaly type 3 and clinical-genetic aspect of Angelman syndrome

Als Mikrozephalie wird der klinische Befund eines reduzierten frontookzipitalen Kopfumfanges um mehr als zwei Standardabweichungen bzw. auf einen Wert unterhalb der 3. Perzentile bezeichnet. Hereditäre Mikrozephalien können sich pränatal (primäre Mikrozephalie) oder postnatal (sekundäre Mikrozephalie) manifestieren, isoliert auftreten oder Teil eines Syndroms sein. Gegenstand meiner Promotionsarbeit waren Untersuchungen zur Pathogenese der Autosomal-rezessiven primären Mikrozephalie Typ 3 (MCPH3) mit biallelen Mutationen des CDK5RAP2-Gens als Beispiel einer isoliert auftretenden primären Mikrozephalie und des Angelman-Syndroms als Beispiel einer syndromalen sekundären Mikrozephalie. Die MCPH zeichnet sich durch eine Entwicklungsstörung des Gehirns mit einem zu geringen Wachstum vorwiegend des Neokortex (graue Substanz) aus, welches sie als Modellerkrankung zur Erforschung der Neurogenese prädestiniert. Ziel dieses Teils meiner Promotionsarbeit war die Etablierung eines in vitro Modells für MCPH3 anhand neural differenzierender muriner embryonaler Stammzellen (mESZ) und die Identifizierung und Charakterisierung potentieller Interaktionspartner von Cdk5rap2. Trotz ubiquitärer CDK5RAP2-Expression manifestiert sich die MCPH isoliert neural, weshalb wir die neurale und nicht-neurale Differenzierung von Cdk5rap2-runterregulierten mESZ näher untersuchten. Nach Induktion der neuralen Differenzierung imponierten in diesen Zellkulturen ein Proliferationsdefekt, ausgeprägte Apoptose zu Beginn der Differenzierung, Störungen der Rosettenbildung, verfrühte Differenzierung und progressiver Zellverlust, wohingegen sich bei der Differenzierung in kontraktile Kardiomyozyten keinerlei Auffälligkeiten im Vergleich zur Kontrollsituation zeigten. Da für Genexpressionsanalysen mittels quantitativer Real-time PCR kein geeignetes Referenzgen zur Verfügung stand, war die Auswahl eines solchen mit dem Ergebnis der Empfehlung von RNA-Polymerase II wichtige Voraussetzung für die weitere Arbeit. Durch massenspektroskopische Analysen konnten etwa 50 potentielle Cdk5rap2-Interaktionspartner identifiziert werden, deren Charakterisierung ein fortlaufendes Projekt unserer Arbeitsgruppe ist. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit der aktuellen Hypothese zur Pathogenese der MCPH, die von einem vorzeitigen Übergang von symmetrischer zu asymmetrischer Zellteilung mit Reduktion des Stammzellpools durch verfrühte Differenzierung und vermehrtem Zelltod ausgeht. Sie legen darüber hinaus nahe, dass Störungen der Zellpolarität und der Ausdifferenzierung eine zusätzliche Komponente darstellen. Unser in vitro Modell bietet vielfältige experimentelle Möglichkeiten, die künftig zum weiteren Verständnis physiologischer und pathogenetischer Zusammenhänge beitragen können. Das Angelman-Syndrom zeichnet sich durch sekundäre Mikrozephalie, mentale Retardierung, Sprachstörungen, Ataxie, Epilepsie und Verhaltensauffälligkeiten aus. Unsere Patientin dagegen fiel früh mit rekurrierenden, teils schweren Infektionen auf und entwickelte dann Symptome, die mit dem Angelman-Syndrom vereinbar waren. Ziel dieses Teils meiner Promotionsarbeit war die Identifizierung der zugrundeliegenden genetischen Ursache. Die Patientin trägt eine für das Angelman-Syndrom typische de novo Deletion in 15q11.2–q13.1 und eine Mikrodeletion in 2q21.3, deren Krankheitsrelevanz nicht ausgeschlossen werden kann. Eine Infektanfälligkeit in diesem Rahmen ist äußerst ungewöhnlich. Wir tragen hiermit zur Erweiterung des Phänotyps des Angelman-Syndroms mit zusätzlicher Symptomatik bei.Microcephaly describes the clinical finding of a reduced occipital-frontal circumference by at least two standard deviations. Hereditary microcephaly appears congenital (primary) or postnatal (secondary), isolated or in the context of a syndrome. My dissertation project addresses two types of hereditary microcephaly: (i) Autosomal recessive primary microcephaly type 3 (MCPH3) with mutations of the CDK5RAP2 gene as an example for isolated primary microcephaly and (ii) the Angelman syndrome as an example for syndromal secondary microcephaly. MCPH is a disorder that affects particularly the in utero neocortical development and is thus a model disease for research on neurogenesis. The aim of this part of my project was the establishment of an MCPH3 in vitro model with murine embryonic stem cells (mESC) in neural differentiation and the identification and characterisation of putative Cdk5rap2 interaction partners. Despite ubiquitous CDK5RAP2 expression MCPH affects particularly the brain, thus we studied neural and non-neural differentiation of Cdk5rap2-depleted mESC. After induction of neural differentiation in these cell lines, we observed imposing proliferation defect and apoptosis, progressive loss of differentiating cells, premature differentiation, and failure of rosette-formation, whereas differentiation into beating cardiomyocytes revealed no abnormality compared to the control situation. A suitable reference gene for further gene expression analysis using quantitative Real-time PCR was not available, so we evaluated candidate genes and recommend RNA-polymerase II for this approach. By mass spectrometry approximately 50 putative Cdk5rap2 interaction partners could be identified. Their characterisation is an on-going project of our group. Our results are in line with the current hypothesis of MCPH pathogenesis, which describes a premature switch from symmetric to asymmetric cell division leading to a reduction of neural progenitor pool due to premature differentiation and increased cell death. In addition, our results imply a role of Cdk5rap2 in cell polarity and differentiation. Our in vitro model provides multiple experimental possibilities addressing the further understanding of physiological and pathogenic mechanisms. The Angelman syndrome is characterized by secondary microcephaly, mental retardation, speech disorder, ataxia, epilepsy, and conspicuous behaviour. Our patient was affected by recurrent, partly severe, infections at early age and developed symptoms leading to clinical diagnosis of Angelman syndrome subsequently. The aim of this part of my project was to explore the underlying genetic cause. Genetic analysis revealed a de novo deletion in 15q11.2-q13.1 typical for Angelman syndrome and a microdeletion in 2q21.3. Relevance for the latter cannot be excluded. An infect susceptibility in the context of Angelman syndrome is very uncommon. In conclusion, this report broadens the phenotype spectrum