The role of miRNAs in the KRAS oncogene-mediated tumorigenesis in the ovarian epithelium

MicroRNAs (miRNAs) kodieren nicht für Proteine, sondern bewirken durch Bindung an die 3‘-untranslatierte Region bestimmter Ziel-mRNAs deren Abbau und hemmen die Translation. In zahlreichen Tumoren ist die Expression von miRNAs verändert; sie können als Onkogene und Tumorsuppressoren wirken. RAS ist das häufigste in menschlichen Tumoren aktivierte Onkogen. Als zentrales Schaltmolekül vernetzter Signalkaskaden entfaltet es seine Hauptwirkungen durch Aktivierung oder Repression transkriptioneller Zielgene. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals die Auswirkungen des RAS-Onkogens auf die miRNA-Expression systematisch erfasst. Der Vergleich immortalisierter und KRAS-transformierter ovarialer Oberflächenepithelzellen der Ratte (ROSE) mittels Microarray-Technologie zeigte 87 durch das RAS-Onkogen regulierte miRNAs, davon waren 27 hoch- und 60 herunterreguliert. Mithilfe pharmakologischer Inhibitoren ließ sich die Regulation von 25 (93 %) der hochregulierten und 23 (38 %) der herunterregulierten miRNAs dem RAS- abhängigen MAPK-Signalweg zuordnen. Der ebenfalls RAS-abhängige PI3K-Signalweg beeinflusste entsprechend 8 miRNAs. Dreizehn (48 %) der hoch- und 27 (45 %) der herunterregulierten miRNAs waren in HRAS-transformierten humanen Zellen in gleicher Weise reguliert, sie bilden eine konservierte miRNA-Signatur. Um die erfassten miRNA-Expressionsveränderungen funktionell zu charakterisieren, wurden die Spiegel ausgewählter herunterregulierter miRNAs in RAS- transformierten ROSE-Zellen durch Transfektion mit in vitro synthetisierten miRNA-Kopien näherungsweise wieder auf Niveaus wie vor der Transformation angehoben. Bei drei miRNAs war in Folge das ankerabhängige, bei zweien das ankerunabhängige Zellwachstum um mehr als 20 % reduziert. Diese miRNAs wirken somit potenziell transformations- und tumorsuppressiv. Die Korrelation algorithmischer Ziel-mRNA Vorhersagen mit gemessenen miRNA- und mRNA- Expressionsdaten ermöglichte schließlich die Identifizierung einer regulatorischen Beziehung zwischen miR-22 und Fosl1, die erstmals zelltyp- und speziesübergreifend mittels Western-Blot-Analysen bestätigt wurde. miR-22 kommt damit eine wichtige Rolle als Proliferationshemmer im Rahmen der RAS- induzierten Transformation zu. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die onkogene Aktivierung von RAS umfangreiche und funktionell relevante Veränderungen der miRNA-Expression nach sich zieht. Die Regulation von Fosl1 durch miR-22 macht deutlich, dass miRNAs ihre Wirkungen im Zusammenspiel mit bekannten zellulären Onkogenen oder Tumorsuppressoren wie Transkriptionsfaktoren entfalten. Die Entschlüsselung weiterer entsprechender molekularer Mechanismen ist entscheidend für ein besseres Verständnis der RAS- induzierten malignen Transformation und schafft neue Ansatzpunkte für Tumordiagnostik und -therapie.MicroRNAs (miRNAs) do not encode proteins, but selectively degrade mRNAs by binding to their 3’ untranslated region (UTR) and inhibit translation. MiRNA expression is altered in a variety of human tumors; in this context miRNAs can act as oncogenes or tumor suppressors. RAS is the most frequently activated oncogene in human tumors. As a central molecular switch of complex intracellular signaling networks the protein mediates its effects mainly through activation or repression of transcriptional targets. In the present work, the effects of oncogenic RAS on miRNA expression were assessed systematically for the first time. Comparison of immortalized versus KRAS- transformed rat ovarian surface epithelial cells (ROSE) by microarray technology revealed 87 differentially expressed miRNAs. Twenty-seven of these were up- and 60 were down-regulated. Using pharmacological inhibitors, the regulation of 25 (93%) of the up-regulated and of 23 (38%) of the down- regulated miRNAs was attributed to the RAS-dependent MAPK pathway. The PI3K pathway – acting downstream of RAS as well – influenced only 8 miRNAs. Thirteen (48%) of the up- and 27 (45%) of the down-regulated miRNAs were regulated in the same way in HRAS-transformed human cells. These miRNAs constitute a conserved miRNA signature. To functionally characterize the miRNA expression changes observed, intracellular miRNA levels were modulated by transfection with miRNA mimics (in vitro synthesized miRNA analogues). In RAS- transformed cells, the levels of a selected set of 7 down-regulated miRNAs were raised separately to levels as in untransformed cells. Three miRNAs inhibited the anchorage-dependent growth and two inhibited anchorage- independent proliferation by more than 20%. These miRNAs are possible tumor suppressors. Finally, the correlation of algorithmic target prediction with miRNA and mRNA expression data allowed the identification of a regulatory relationship between miR-22 and the transcription factor Fosl1. This functional link was confirmed to be a species- and cell type-spanning mechanism by Western Blot analyses. Therefore, miR-22 has to be considered as an important proliferation inhibitor in the context of the RAS-induced malignant transformation. Taken together, oncogenic activation of RAS induced profound and functionally relevant miRNA expression changes. The regulation of Fosl1 by miR-22 indicates that miRNAs exhibit their functions not alone but in conjunction with known cellular oncogenes and tumor suppressors, e. g. transcription factors. Comprehensive deciphering of molecular mechanisms will be crucial for a better understanding of the RAS-induced malignant transformation and generate new options for tumor diagnostics and therapy