Zur Etablierung und Charakterisierung eines humanen Ko-Kultur-Hautmodells mit SZ95 Sebozyten

The maintenance of normal human sebocytes in organ culture and in vitro is extremely difficult and barely reproducible, mainly because the cells are programmed to differentiate and undergo holocrine secretion, i.e. cell membrane rupture and release of their content. Therefore, we developed a skin explant model, where skin specimens are co-cultured for 6 days with a monolayer cell culture of the immortalized human SZ95 sebaceous gland cells (sebocytes). Through model variation the molecular cross-talk between SZ95 sebocytes and the skin specimens is possible both through direct cell-tissue as well as humoral contact. The structural integrity of the skin explant epidermis was facilitated through the co-culture in direct contact. Parallel co-cultures with human fibroblasts provided evidence for the cell type specificity of the aforementioned results. Interestingly, the presence of SZ95 sebocytes in the culture system in direct contact with the skin specimens reduced the secretion of IL-6 by the latter. Immunohistochemical labelling with antibodies raised against IL-6 and IL-8, showed that IL-6 was expressed in both the epidermal as well as the dermal component of the skin explants, while IL-8 was not expressed from the epidermal keratinocytes. Stratum corneum excessive thickness and size of the vital non-cornified epidermis were modified towards normalization after direct contact co-culture of the explants with SZ95 sebocytes. In addition, DNA fragmentation (TUNEL technique) showed decreased apoptosis and Ki67 immunostaining a partial conservation of Ki67 expression in basal epidermal keratinocytes of the skin specimens co-cultured with SZ95 sebocytes, indicating a normalising effect of SZ95 sebocytes towards the ex vivo skin homeostasis. On the other hand, SZ95 sebocytes co-cultured with skin specimens in direct contact exhibited increased lipid accumulation and stronger expression of the differentiation markers keratin 7 and epithelial membrane antigen, suggesting that this co-culture setting promoted their differentiation. Surprisingly, the aforementioned beneficial effects of SZ95 sebocytes on skin homeostasis and of skin explants on sebaceous differentiation were not observed in humoral-contact co-cultures. Spontaneous LDH release did not exhibit significant differences between direct or humoral co-cultures and controls and western blots of skin explant lysates deriving from humoral co-culture experiments and controls did not exhibit visible differences in caspase-3 activation as initiator of apoptosis. These data underline a cross-talk of human sebocytes and skin specimens under specific co-culture conditions but also a major role of sebocytes in skin homeostasis, proposing their addition to three-dimensional skin models.Die Kultivierung normaler humaner Sebozyten in der Organkultur und in vitro ist besonders anspruchsvoll und schwer reproduzierbar, hauptsächlich weil die Zellen differenzieren und einer holokrinen Sekretion sich unterziehen, i.e. Zellmembranruptur und Freisetzung ihres Inhalts. Aus diesem Grund haben wir ein Hautexplantatmodel entwickelt, in welchem Hautproben über 6 Tage mit Einschichtzellkulturen von immortalisierten humanen SZ95-Talgdrüsenzellen kokultiviert wurden. Durch Variationen des Modells konnte man die molekulare Wechselwirkung zwischen Zellen und Haut beim direkten und humoralen Kontakt untersuchen. Die strukturelle Integrität der Hautexplantat-Epidermis wurde durch die Kokultur im direkten Kontakt begünstigt. Die parallele Kokultur mit humanen Fibroblasten als Kontrolle bewies die Zelltypspezifität der Ergebnisse. Interessanterweise reduzierte die Präsenz von SZ95-Sebozyten in der Kokultur in direktem Kontakt mit der Haut die Sekretion von IL-6 aus den Hautproben. Immunohistochemische Färbung mit Antikörpern gegen IL-6 und IL-8 wiesen IL-6 im epidermalen und dermalen Komponent der Hautexplantaten nach, jedoch wurde IL-8 nicht von den epidermalen Keratinozyten exprimiert. Die exzessive Verdickung des Stratum Corneum und die Größe der vitalen nicht kornifizierten Epidermis wurden durch die Kokultur der Hautexplantaten mit SZ95-Sebozyten in direktem Kontakt normalisierend beeinflusst. Darüber hinaus wurde mit Hilfe der DNS-Fragmentation (TUNEL-Methode) eine reduzierte Apoptose und mit Hilfe der Immunfärbung gegen das Ki67-Antigen eine partiale Konservierung der Ki67-Expression in basalen epidermalen Zellen gezeigt, die auf ein normalisierendes Effekt auf die ex-vivo-Homeostase der Haut hinwies. Auf der anderen Seite, zeigten die in direktem Kontakt mit der Haut kokultivierten SZ95-Sebozyten eine erhöhte Lipidakkumulation und stärkere Expression von Keratin 7 und epithelialem Membran-Antigen. Das wies auf die Förderung der sebozytären Differenzierung durch die Kokultivierung auf. Die o.g. positiven Effekte wurden im Fall der humoralen Kokultur weder Effekte der SZ95-Sebozyten auf die ex-vivo-Haut Homeostase noch der Haut auf die sebozytäre Differenzierung beobachtet. Die spontane LDH Freisetzung zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen direkten bzw. humoralen Kokulturen und Kontrollen. Darüber hinaus konnte mittels der Westernblotmethode bei humoralen Kokulturen und Kontrollen keine Aktivierung von Caspase-3 als Initiator der Apoptose nachgewiesen werden. Zusammenfassend stellen die o.g. Daten eine Wechselwirkung zwischen humanen Sebozyten und ex vivo-Hautproben unter spezifischen Kulturbedingungen heraus. Außerdem wurde eine wichtige Rolle der Sebozyten für die Hauthomeostase nachgewiesen, welche für ihre Hinzufügung in zukünftigen dreidimensionalen Hautmodellen spricht