Phototoxic and photoallergic potential of drugs-development of an in vitro screening method

Titel, Inhaltsverzeichnis 1\. Einleitung und Zielstellung 1 2\. Theoretischer Teil 3 3\. Ergebnisse und Diskussion 21 4\. Zusammenfassung 120 Summary 122 5\. Experimenteller Teil 124 6\. Anhang 132 7\. Literaturverzeichnis 133 PublikationDas Ziel dieser Arbeit, die Kopplung der Photochemie im rein wässrigen Milieu mit der Hochleistungsflüssigchromatographie, wurde erfolgreich umgesetzt. Unter Verwendung einer Säulenschaltung konnte der Photoreaktor mit dem chromatographischen System gekoppelt werden. Die Anreicherung und Chromatographie erfolgte mit zwei speziellen Aqua Säulen. Die im Rahmen dieser Arbeit erstmals entwickelte HPLC online Methode konnte erfolgreich zu Photostabilitätsprüfungen bei variablen pH-Werten und mit unterschiedlichen Lichtquellen eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von verschiedensten Arzneistoffen. So konnten sowohl polare als auch lipophile Arzneistoffe untersucht werden. Besonders hervorzuheben ist die Anwendung dieser Methode zum Screening auf phototoxische oder photoallergene Reaktionen von Arzneistoffen. Zur Testung auf phototoxische Reaktionen wurde die DNA-Base Guanosinmonophosphat als Modellsubstanz verwendet. Die Arzneistoffe Chlorpromazin und Ofloxacin zeigten unter Belichtung mit UV-A Licht Wechselwirkungen und Reaktionen mit der DNA-Base und die phototoxische Wirkung dieser Stoffe konnte mit dieser Methode bestätigt werden. Auf der anderen Seite zeigte das Diuretikum Hydrochlorothiazid keine Reaktion mit GMP, obwohl der Stoff in der Literatur als phototoxisch beschrieben wurde. Durch die Verwendung eines kurzen DNA-Einzelstranges anstatt der Base GMP konnte eine Reaktion von Hydrochlorothiazid unter Belichtung mit dem DNA-antisense-Strang nachgewiesen werden. In Versuchen mit dem DNA-sense-Strang konnte hingegen keine Wechselwirkung festgestellt werden. Zur Testung auf photoallergische Reaktionen erwies sich das Dipeptid Alanyltryptophan als Modellsubstanz für besonders geeignet. Die Versuchsergebnisse zum Screening auf Photoallergenität korrelierten gut mit den Angaben aus der Literatur. Die Photoallergenität konnte für die Phenothiazine, Hydrochlorothiazid, Ofloxacin und Mefloquin durch die Wechselwirkung oder Reaktion mit dem Dipeptid bestätigt werden. Bestätigt wurde die Theorie, dass häufig halogenierte Arzneistoffe an photochemischen Reaktionen mit Biomolekülen beteiligt sind. Die halogenierten Arzneistoffe Chlorpromazin, Hydrochlorothiazid, Ofloxacin und Mefloquin erwiesen sich als besonders reaktiv in Gegenwart von Biomolekülen. Die nicht halogenierten Arzneistoffe Etodolac und Nifedipin zeigten zum Vergleich kaum Reaktionen mit den Biomolekülen. Insgesamt hat sich in den durchgeführten Untersuchungen eine ausgeprägte pH-Abhängigkeit gezeigt. Dabei ist das Spektrum der resultierenden Photoprodukte stark vom pH-Wert abhängig und somit auch die Reaktivität der Photoprodukte mit den Biomolekülen. Mit den Untersuchungsergebnissen lässt sich eine sequenzabhängige Schädigung der DNA- Einzelstränge belegen. Die Chromatogramme von dem DNAa-Strang zeigten in Anwesenheit von Hydrochlorothiazid, Eosin und Protoporphyrin eine Schädigung der DNA, während vergleichend die Untersuchungsergebnisse zu dem DNAs-Strang eine größere Stabilität zeigten. Im Vordergrund steht die Nutzung dieser Methode zum Screening auf ein mögliches phototoxisches und photoallergenes Potential von Arzneistoffen. Bei Arzneistoffen, die sich in der Entwicklung befinden, könnte frühzeitig ein phototoxisches oder photoallergenes Potential erkannt werden. Mit dieser Methode steht eine kostengünstige Alternative zu herkömmlichen Methoden zur Verfügung. Im Vergleich sind Tierversuche sehr zeitaufwendig und damit auch kostenintensiv. Ausgehend von den vorgestellten Ergebnissen ergeben sich zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten. Mit dieser Methode könnten neue Erkenntnisse zu Wirkungsmechanismen von Photosensibilisatoren in der Photodynamischen Therapie gewonnen werden.The purpose of this work, the coupling of the photochemistry in the purely watery environment with the high performance liquid chromatography, was moved successfully. The HPLC on-line method was developed by using a hyphenated technique comprising a photoreactor and HPLC separation. The enrichment and chromatography occurs with two special aqua columns. The developed HPLC on- line method was used successfully for photostability testing with variable pH factors and with different sources of light. The described method allows the investigation of the most different drugs. Thus, polar as well as lipophilic drugs could be investigated with this method. Especially the application of this method the screening on phototoxic or photoallergic reaction by drugs is to be emphasised. For screening phototoxic reactions the DNA base guanosinemonophosphate was used as model substance. The drugs chlorpromazine and ofloxacine showed under exposure with UVA light interaction and reaction with the DNA base and the phototoxic effect of these drugs could be confirmed with this method. On the other side the diuretic drug hydrochlorothiazide showed no reaction with GMP, although the drug was described in the literature as phototoxic. A reaction of hydrochlorothiazide could be proved by the use of short DNA antisense single-strand instead of the base GMP under exposure with UVA light. However, in attempts with the DNA sense single-strand no interaction could be ascertained. For the screening on photoallergic reaction of drugs the dipeptide alanyltryptophan was used as model substance. The test results to the screening on photoallergy well correlated with the information from the literature. The photoallergic potential could be confirmed for the phenothiazines, hydrochlorothiazide, ofloxacine and mefloquine by the interaction or reaction with the dipeptide. The theory was confirmed that often halogenated drugs are involved in photochemical reactions with biomolecules. The halogenated drugs chlorpromazine, hydrochlorothiazide, ofloxacine and mefloquine turned out especially reactive in present of biomolecules. The not halogenated drugs etodolac and nifedipine showed to the comparison weak reaction with biomolecules. All together distinctive pH dependence has appeared in the carried out investigations. A damage dependent on sequence of the DNA single-strand can be booked with the investigation results. The chromatograms of the DNA antisense strand showed in presence of hydrochlorothiazide, eosine and protoporphyrine a damage or structure change of the DNA antisense strand, while the comparative investigation results showed higher stability to the DNA sense strand. The main application of the described HPLC on-line method is the screening on photoallergic and phototoxic potential of drugs. Drugs in development could be tested with this method in early stage. This method is a low cost alternative to conventional methods. In comparison animal experiments are very time-consuming and are also cost- intensive with it. Outgoing from the introduced results numerous other application possibilities arise. With the developed method new knowledge could be won to understand mechanisms by photosensitizers in photodynamic therapy