Investigations for the evolution of not-O157-STEC-trunks

Deckblatt Inhaltsverzeichnis Einführung 5 Elektrophorese und das Paradebeispiel der Klonalität 9 Gensequenzen 12 das Spezies-Problem 15 Eigene Arbeiten 17 Material 17 Bakterienstämme 17 Nährmedien 19 Oligonukleotide 20 vorgefertigte Reagenzien 24 Methoden 26 Isolierung von Nukleinsäuren 26 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 28 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 30 Elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren 31 Hybridisierung 31 DNA-Sequenzanalyse 31 Computergestützte Datenanalyse - Datensatzanalyse 32 Eigene Ergebnisse 33 DNA-Sequenzanalyse 33 Sequenzlänge 33 Anzahl der Variationen bei den folgenden Stämmen 33 Housekeeping-Gene 34 PCR-Elektropherogramm (Beispielhaft für alle weiteren Gene) 35 Nachweis des cadB-Gens mittels Dot-Blot-Hybridisierung 36 Virulenzassoziierte Gene 37 Phylogenetische Analysen 44 Houskeeping-Gene 44 Virulenzassoziierte Gene 56 Diskussion 100 Zusammenfassung 114 Summary 116 Abbildungsverzeichnis 118 Tabellenverzeichnis 118 Nachweis der verwendeten Quellen 119 Danksagung 134In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST) die Verwandtschaftsverhältnisse von 25 bovinen Nicht-O157:H7 -Shigatoxin-bildenden Escherichia coli (STEC) -Stämmen bestimmt und mit einem O157:H7-Stamm sowie dem E. coli K12-Referenzstamm MG1655 verglichen. Für die phylogenetischen Untersuchungen wurden einerseits die vier Housekeeping-Gene cadB (442 bp), mdh (810 bp), putP (483 bp) und trpC (420 bp) partiell sequenzanalysiert. Weiterhin wurden Gene des über horizontalen Gentransfer erworbenen Locus of Enterocyte Effacement (LEE) analysiert, und zwar die hochvariablen Virulenzgene eae (895 bp) und espB (374 bp). Anhand der Daten wurden Kladogramme erstellt, deren Vertrauenswürdigkeit durch eine kombinierte Analyse in einem Maximum-Parsimonie-Baum (MPT) visualisiert wurde. Ziel der Untersuchungen war es, die mögliche Entwicklungsgeschichte dieser LEE- positiven bovinen STEC-Stämme nachzuzeichnen. Die Analyse der Housekeeping-Gene erbrachte das Vorhandensein von möglicherweise sechs verschiedenen Clustern. Eine endgültige Clusterbestimmung hätte die Sequenzanalyse weiterer Housekeeping-Gene sowie einen größeren Datensatz erfordert. Bezüglich der Virulenzgene stimmten die phylogenetischen Daten der espB und eae-Gene weitestgehend überein, was als Hinweis auf deren Co-Evolution gewertet wird. Weiterhin zeigte sich eine absolute Assoziation zwischen den 8 verschiedenen nachgewiesenen Intimintypen und der phylogenetischen Verwandtschaft der Stämme. Demnach kann das Intimin als phylogenetischer Marker gewertet werden. Die aus der Analyse der Housekeeping-Gene getroffene phylogenetische Entwicklung der Stämme wurde weiterhin in Einklang gebracht mit den Daten der LEE-assoziierten Gene, um einen möglichen Zeitpunkt der Übertragung des LEE abschätzen zu können. Aufgrund der geringen Zahl untersuchter Gene konnte keine endgültige Hypothese erstellt werden, allerdings sprechen die Daten eher dafür, dass der LEE mehrfach und unabhängig voneinander in verschiedene E. coli-Phylotypen inserierte. Nach Integration des LEE in das jeweilige E. coli- Chromosom fand dann die jeweilige Weiterentwicklung des LEE statt, die anhand der Gene eae und espB analysiert wurde. Die unterschiedlichen Entwicklungen finden in den deutlichen Sequenzgrößen- und Sequenzfolgen-Unterschieden einen klaren Ausdruck. Sie enthüllten Clusterbildungen bei den Housekeeping-Genen, die durch unterschiedliche Mutationen über die Zeit entstanden sein müssen. Daraus wird der Schluss gezogen, dass es sich um wenigstens fünf, mutmaßlich jedoch sogar sechs, verschiedene Cluster handelt, die nur zum Teil die Einteilung durch Whittam (Whittam, 1998) und Reid (Reid et al., 1999; Reid et al., 2000), über die MLEE (Selander and Lewin, 1980; Selander et al., 1986) bestätigen. Diese Cluster spiegeln sich auch in denen der Virulenzgene wieder, so dass davon ausgegangen werden kann, dass es sich jeweils um eine unabhängige Aufnahme eines LEE, aber unterschiedliche Weiterentwicklung seit diesem Zeitpunkt handelt. Die deutlichsten Veränderungen, die sich am zeta- Cluster zeigten, könnten auf einem relativ höheren Selektionsdruck beruhen, oder aber auch einfach dadurch zustande gekommen sein, dass sie eine längere Zeit der Entwicklung hatten, also schlichtweg älter sind. Diese Hypothesen müssen in umfangreicheren zukünftigen Untersuchungen belegt bzw. widerlegt werden. Zur Darstellung einer Zeitskala fehlen geeignete sog. "Outgroups", so dass die Trennungszeiten der einzelnen Klone nicht geschätzt werden können. Somit ist auch keine Aussage darüber möglich, welcher Klon sich von welchem Ursprungsklon zu welchem Zeitpunkt getrennt hat. Die Analysen deuten jedoch darauf hin, dass der LEE mehrfach und zu unterschiedlichen Zeiten von den einzelnen Klonen aufgenommen worden ist.This thesis describes the determination of the relationships between of 25 bovine non-O157:H7 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains by multilocus sequence typing (MLST) and compared with an O157:H7 strain and the E. coli K12 reference strain MG1655. For the phyologenetic analyses the four housekeeping genes cadB (442 bp), mdh (810 bp), putP (483 bp) and trpC (420 bp) were subjected to partial sequence analysis. Genes of the locus of enterocyte effacement (LEE) acquired by horizontal gene transfer, i.e. the highly variable virulence genes eae (895 bp) and espB (275 bp) were also analysed. Cladograms were established on the basis of the data obtained. The reliability of the cladograms was visualised by means of a combined analysis in a maximum parsimony tree (MPT). The aim of the investigations was to trace the possible developmental history of these LEE-positive bovine STEC strains. The analysis of the housekeeping genes revealed the presence of possibly six different clusters. Sequence analysis of further housekeeping genes and a larger amount of data would have been necessary to arrive a final determination of the clusters. As regards the virulence genes, the phylogenetic data on the espB were more or less the same as those of the eae gene, which can be taken as an indication of their co-evolution. There was also an absolute association between the 8 different types of intimin identified and the phylogenetic relationships between the strains. Intimin can thus be considered to be a phylogenetic marker. The phylogenetic development of the strains as established by the analysis of the housekeeping genes was also compared with the data on the LEE-associated genes, in order to be able to estimate the time at which the LEE may have been transferred. Owing to the small number of genes investingated it was not possible to arrive at a final hypothesis, however, from the data it would appear that the LEEs were inserted several times in different E. coli phylotypes, independently of each other. The further development of the respective LEEs took place following integration of the LEE in the respective E. coli chromosomes and they were then analysed separately for the genes eae and espB. The differences between their developments are clearly reflected in the pronounced differences in sequence size and sequence order. Thus, they revealed the formation of clusters of the housekeeping genes which must have developed as a result of different mutations over time. This led to the conclusion that there are at least five, probably even six different clusters which only partly confirm the serotypes established by Wittam (Whittam, 1998) and Reid (Reid et al., 1999; Reid et al., 2000) the aid of MLEE (Selander and Lewin, 1980; Selander et al., 1986). These clusters are also reflected in the virulence genes and it can thus be assumed that each strain inserts an LEE independently of the others, but that its development takes a different course from this time onwards. The most pronounced changes revealed in the zeta cluster may have been attributable to a relatively higher selection pressure or have come about purely because they needed longer to develop, i.e. were simply older. More comprehensive research is needed to confirm or reject these hypotheses. The "outgroups" that would be required to represent a time scale do not exist and it was thus not possible to estimate the separation times of the individual clones. It is therefore also not possible to establish which clone separated from which progenitor clone at which point in time. However, the results of the analyses indicate that the LEE was inserted by the individual clones at several different times