Structure and function of the tight junction protein occludin under normoxic and hypoxic conditions

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Abbildungsverzeichnis 4 Tabellenverzeichnis 7 Abkürzungsverzeichnis 8 1 Einleitung 11 1.1 Epithelien und Endothelien 11 1.2 Tight junctions 12 1.3 Proteine der tight junctions 13 1.3.1 Claudine 13 1.3.2 Occludin 15 1.3.2.1 Aufbau und Eigenschaften von Occludin 15 1.3.2.2 Posttranslationale Modifikationen 17 1.3.2.3 Krankheitsrelevanz von Occludin 21 1.3.3 Trizellulin 27 1.3.4 MarvelD3 27 1.3.5 Weitere tight junction-assoziierte Proteine 28 1.4 Fragestellungen 29 2 Material und Methoden 32 2.1 Materialien 32 2.1.1 Geräte, Chemikalien, Enzyme, Medien und Antikörper 32 2.1.2 Bakterienstämme und eukaryotische Zelllinien 34 2.2 Molekularbiologische Methoden 35 2.2.1 Klonierung von humanem Occludin in CFP- und YFP-Expressionsvektoren 35 2.2.2 Ortsgerichtete Mutagenese 36 2.2.3 Transformation 38 2.2.4 DNA-Sequenzierung 38 2.3 Zellkultur und proteinbiochemische Methoden 39 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zelllinien 39 2.3.2 Transiente und stabile Transfektion eukaryotischer Zelllinien 40 2.3.3 Anlage und Reaktivierung von Kryokulturen eukaryotischer Zelllinien 41 2.3.4 Zellfixierung und immunocytochemische Färbung 42 2.3.5 Analyse lebender Zellen mit dem laser scanning-Mikroskop 42 2.3.6 Zelllyse, SDS-PAGE und Western Blot 43 2.3.7 Massenspektrometrie 44 2.3.8 Membranlokalisationsstudien 45 2.3.9 Messung der trans-Interaktionen (Anreicherungsstudien in Zell- Zellkontakten) 45 2.3.10 Messung der cis-Interaktionen (fluorescence resonance energy transfer) 46 2.3.11 Mobilitätsuntersuchungen (fluorescence recovery after photobleaching) 48 2.3.12 Dichtheitsmessungen (TEER-Messungen und Cellmask-Diffusionsassay) 50 2.3.13 Gefrierbruchelektronenmikroskopie 50 2.4 Sequenzalignements 51 2.5 Molekulare Modellierung 51 2.6 Statistik 52 3 Ergebnisse 53 3.1 Redoxsensitivität von Occludin 53 3.1.1 Occludin reagiert sensitiv auf oxidativen Stress 53 3.1.2 Cysteinaustauschmutanten induzieren veränderte Occludin-Expressionsmuster, trans- und cis-Interaktionen und bestimmen in der zweiten extrazellulären Schleife die Redoxsensitivität von Occludin 55 3.1.3 Einfluss von Dithiothreitol auf Occludin und seine Cysteinmutanten 62 3.1.4 Auswirkung veränderter Redoxverhältnisse auf die Dimerisierung von Occludin 64 3.1.5 Identifizierung einer in die cis- und trans-Homooligomerisierung involvierten Disulfidbrücke in der zweiten extrazellulären Schleife von Occludin 66 3.1.6 Rolle von Transmembrandomänen bei der Homooligomerisierung von Occludin 68 3.1.7 Einfluss von Cysteinmutationen auf die parazelluläre Dichtheit 69 3.1.8 Occludin veränderte die phänotypischen Strangeigenschaften von Claudin-1 71 3.1.9 In silico- Modellierung der zweiten extrazellulären Schleife von Occludin 72 3.1.10 Zweite extrazelluläre Schleife und Transmembrandomäne 1 - Bindungsareale für die Homooligomerisierung von Occludin 73 3.2 Phosphorylierungsabhängige Regulation der Interaktion Occludins mit ZO-1 sowie seiner Homodimerisierung 73 3.3 Tyrosinreste als weitere Determinanten der Dimerisierung und Funktion von Occludin 76 3.3.1 Membranlokalisations- und Dimerisierungsverhalten der Mutante Y220A 76 3.4 Der Cellmask-Diffusionsassay als Alternative zu Widerstands- und Permeabilitätsmessungen 79 3.5 Cysteinbasierte Interaktionen zwischen Occludin und Claudin-1 82 3.6 Cysteinbasierte Interaktionen zwischen Occludin und MarvelD3 83 4 Diskussion 85 4.1 Redoxsensitivität und deren strukturelle sowie funktionelle Konsequenzen für Occludin und die tight junction 85 4.2 Die Rolle membranständiger Cysteine bei der Homooligomerisierung von Occludin 93 4.3 Tight junction-Physiologischer Einfluss der Cysteinausauschmutanten von Occludin 95 4.4 Regulation der Homodimerisierung von Occludin und seiner strukturgebenden Assoziation zu ZO-1 durch Caseinkinase2- gesteuerte Occludinphosphorylierung 99 4.5 Eigenschaften der Occludinmutante Y220A 101 4.6 Dichtheitsmessungen mittels Cellmask- Diffusionsassay an occludin- transfizierten HEK-293-Zellen 102 4.7 Heterologe cysteinbedingte Interaktion von Occludin mit MarvelD3 104 5 Zusammenfassung 106 6 Summary 108 7 Literaturverzeichnis 110 8 Verzeichnis der eigenen Publikationen 135 9 Lebenslauf 137 10 Eidesstattliche Erklärung 138 11 Appendix 1395\. Zusammenfassung TJs sind Multiproteinkomplexe, die die parazelluläre Permeation hydrophiler Substanzen über Endo- und Epithelien regulieren. Sie determinieren die Zellpolarität und sind an zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Die Rolle des TJ-Markerproteins Occludin ist unklar. Die Arbeit analysiert insbesondere die Interaktionseigenschaften von Occludin nach systematischem Alaninscan hochkonservierter Cysteine. Weiterhin wurde die Regulation dieser Eigenschaften sowohl durch Hypoxie und Reduktantien als auch durch Phosphorylierung untersucht. Ein zusätzlicher Aspekt ist die Analyse der Auswirkungen der Cysteinsubstitutionen auf funktionelle Parameter (Dichtheit, Diffusibilität) und die Strangmorphologie. Die Untersuchungen ergaben, dass die EZS2 von Occludin eine cysteinabhängige und somit redoxsensitive Oligomerisierungsdomäne darstellt. Die Ausbildung einer abgeschirmten, intramolekularen Disulfidbrücke zwischen beiden EZS2-lokalisierten Cysteinen (Cystein216 und -237) bedingt eine aus zwei ß-Strängen und einer α-Helix bestehende Struktur. Diese bestimmt die trans- und cis-Interaktionen sowie die Membranlokalisation und -mobilität von Occludin und geht unter reduzierenden Bedingungen (Hypoxie, DTT) verloren. Die Disulfidbrücke kann als Ursache der Redoxsensitivität von Occludin angesehen werden. Die Gesamtheit der Resultate bezüglich der EZS2 führte zur Konstruktion eines ersten molekularen Modells. Das Cystein82 (TMD1) wurde als Bestandteil einer weiteren Interaktionsfläche von Occludin, innerhalb der Zellmembran, identifiziert. Diese Interaktion ist jedoch nicht redoxsensitiv, sondern beruht möglicherweise auf intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen mit benachbarten Resten. Der Austausch von Cystein82 wirkt sich nur auf die homologen cis-Interaktionen, nicht aber auf die homologen trans-Interaktionen aus. Die Cysteine76 (TMD1) und -148 (TMD2) verstärken die trans-Interaktion von Occludin, sind aber nicht redoxsensitiv. Die starke Zunahme der trans- Interaktion nach Austausch gegen Alanin scheint Ergebnis einer durch die Mutationen wegfallenden räumlichen Behinderung zu sein. Es konnte belegt werden, dass sich reduzierende Bedingungen direkt auf bereits membranständiges Occludin auswirken. Durch den Verlust der Disulfidbrücke verändert sich die EZS2-Struktur, was zur Internalisierung von Occludin führt. Dieses Resultat unterstreicht das Konzept von Occludin als Redoxsensor. Untersuchungen mittels FRET ergeben eine Interaktion zwischen Occludin und Claudin-1. Weiterhin ist ein deutlich verstärkender Einfluss der OccludinC76A Mutante, auf die Strangdichte und -länge von Claudin-1 in HEK-Zellen und den transzellulären Widerstand von MDCK-II-Zellen nachweisbar. FRET-Messungen zwischen ZO-1 und Occludinmutanten, die CK2-Phosphorylierung imitieren bzw. inhibieren, zeigten reduzierte Heterooligomerisierung durch Imitation der CK2-Phosphorylierung. Auch die Homooligomerisierung von Occludin ist CK2-beeinflusst. Das heißt, CK2-bedingte Phosphorylierung beeinträchtigt die TJ-Ausbildung. Die Mutante Y220A (Bestandteil der EZS2-Tertiärstruktur) vermindert die homophile trans- Interaktion sowie deren Redoxsensitivität unter Hypoxie. Die Cysteine76, -82 und -216 von Occludin beeinflussen dessen Interaktion mit MarvelD3. Für Cystein82 konnte ein Einfluss auf die heterologe Interaktion von Occludin mit Claudin-1 ausgeschlossen werden. Insgesamt trägt die Analyse cysteinbasierter Interaktionen durch Identifikation heterologer und homologer Interaktionsbereiche dazu bei die molekulare und regulatorische Organisation von TJs besser zu verstehen.6 Summary TJs are multiprotein complexes regulating the epi-/endothelial permeation of hydrophilic substances. They determine cell polarity and play a central role in lots of physiologic and pathologic processes. The role of occludin, a marker protein of TJs, is unclear. Particularly, interaction properties of occludin were studied by systematic alanine scan of highly conserved cysteine residues. Furthermore, regulation of these properties by hypoxia/ and/or reductants as well as phosphorylation were analyzed. An additional aspect is the investigation of the impact of the cysteine substitution on functional parameters (i.e. tightness) and strand morphology. The results show, that the ECL2 of occludin is a cysteine-dependent and thus redox-sensitive oligomerization domain. Formation of a shielded intramolecular disulfide bridge between the ECL2 localized cysteines216 and -237 causes a tertiary structure, consisting of two ß-strands and an α-helix. This structure determines the cis- and trans-interactions as well as membrane localization and mobility at cell cell-contacts and gets lost under reducing conditions (i.e., hypoxia, DTT). This disulfide bridge is thought to base the redox sensitivity of occludin. The ECL2-related results led to the construction of the first molecular model of this loop. Cysteine82 (TMD1) is part of another interaction face of occludin within the cell membrane. The interaction based on this residue is not redox sensitive but probably based on intermolecular hydrogen bonds with neighboured residues. The only impact of cysteine82-substitution was the reduction of homologous cis-interactions. Trans-interactions were unaffected. Cysteines76 (TMD1) and -148 (TMD2) enhance homologous trans-interactions, but are not redox sensitive. The strong increment of the trans-interactions after substitution of cysteine by alanine seems to be the result of a mutation-based abolition of a spatial hinderence. It could be prooven, that reducing conditions influence membrane incorporated occludin. The ECL-2 structure changes by the loss of the disulfide bridge, which leads to the internalization of occludin. This result emphasizes the concept of occludin as redox sensor. FRET-investigations show an interaction between occludin and claudin-1. The occludin C76A mutant increases the claudin-1-based strand-density and -length in HEK-cells and the TEER in MDCK- II-cells. Associations between ZO-1 and occludin mutants, imitating or inhibiting CK2-phosphorylation measured by FRET, show reduced heterooligomerization and homooligomerization of occludin due to imitation of CK2-phosphorylation. This means, phosphorylation by CK2 modulates TJs. The mutant Y220A (part of the ECL2 tertiary structure) reduces homophilic trans- interactions and their redox sensitivity under hypoxia. Occludins cysteines76, -82 and -216 influence the interaction with marvelD3. For cysteine82, an influence on the interaction between occludin and claudin-1 could be excluded. In conclusion, the analysis of cysteine-based interactions leads to a better understanding of the molecular and regulatory organization of TJs by identification of heterologous and homologous interaction sites