The biological significance of genetic alterations (K-Ras and p53) in pancreatic adenocarcinoma

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1\. Einleitung 2\. Zielstellung 3\. Material und Methoden 4\. Ergebnisse 5\. Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Eigene Veröffentlichungen Danksagung Erklärung an Eides StattDas Pankreaskarzinom ist eine der aggressivsten Tumorarten. Die einzelnen Krankheitsstadien mit Initiation und Progression sind von aktivierenden Mutationen in Proto-Onkogenen (z.B. K-Ras) und funktionellen Inaktivierungen von Tumorsuppressorgenen wie p16, p53 und DPC4 charakterisiert. Mindestens eins dieser vier Gene ist im Pankreasadenokarzinom verändert. Das Zusammenwirken dieser genetischen Veränderungen führt zur Inaktivierung wesentlicher zellulärer Regulations- und Kontrollmechanismen und ermöglicht die maligne Transformation duktaler Pankreaszellen. Dabei spielen Veränderungen im Proto-Onkogen K-Ras und im Tumorsuppressorgen p53 eine große Rolle und die Auswirkungen auf Tumorprogression, -invasivität, Angiogenese- und Metastasierungsverhalten konnten für das Pankreasadenokarzinom noch nicht vollständig geklärt werden. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der Kombination eines Tetrazyklin induzierbaren Systems mit dem orthotopen Mausmodell ein neuer Ansatz zur Untersuchung der biologischen Bedeutung bestimmter genetischer Veränderungen für die komplexen Aspekte der Tumorbiologie des Pankreaskarzinoms aufgezeigt. Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei Pankreasadenokarzinom-Zelllinien mit gut induzierbarer Expression des Tumor- suppressors p53 (wt p53) etabliert. Nach Induktion von wt p53 durch Doxyzyklin (Dox) konnte in den beiden Zelllinien, MiaPaCa-2 und DanG, nicht nur die Expression, sondern auch wesentliche biologische Funktionen des Tumorsuppressors in vitro bestätigt werden. So war eine ausgeprägte Induktion des CDK-Inhibitors p21 mit begleitendem G1-Zellzyklusarrest zu beobachten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden MiaPaCa-2-Zellen mit induzierbarer wt p53-Expression in orthotoper Lokalisation zur Induktion von Tumoren in Nacktmäusen implantiert, um die biologische Funktion von wt p53 in vivo für komplexe Aspekte der Tumorbiologie des Pankreaskarzinoms zu untersuchen. Sowohl bei Behandlungsbeginn mit dem Zeitpunkt der Zellimplantation als auch bei spätem Behandlungsbeginn in bereits etablierten Tumoren konnte durch die wt p53-Induktion das Tumorwachstum hochsignifikant reduziert werden. Des Weiteren verringerte sich die Anzahl makroskopisch erkennbarer intraabdomineller Tumorzell-Auflagerungen in den mit Dox behandelten Tieren zu beiden Induktionszeitpunkten. Allerdings verursachte die induzierte wt p53-Expression zu einem frühen Zeitpunkt des Tumorwachstums eine signifikante Erhöhung der CD31 und Lyve-1 dargestellten Gefäße in Bezug auf die Kontrolltumore, was eine gesteigerte Angiogeneserate bedeutete. Diese vermehrte Gefäßbildung könnte Grund für die erhöhte Metastasierung, festgestellt in den Leberhilus-Lymphknoten in den mit Dox behandelten Tieren, gewesen sein. In den bereits etablierten Tumoren konnte nach wt p53-Induktion eine nicht signifikante Reduktion der CD31 und CD34 dargestellten Gefäße und eine signifikant erhöhte Lymphgefäßrate festgestellt werden. Die Daten an den orthotopen MiaPaCa-2-Tumoren lassen mit der Wachstumsinhibition des Primärtumors Effekte erkennen, die mit der bekannten biologischen Funktion des Tumorsuppressors gut vereinbar sind. Erstmalig deutet das vorliegende Modell aber die Möglichkeit der Begünstigung von Lymphangiogenese und lymphogener Metastasierung an. Diese Untersuchungen liefern einen interessanten Beitrag zum vertieftenden Verständnis der Pathobiologie des Pankreaskarzinoms.Pancreatic cancer is one of the most aggressive diseases. Sequential stages of disease initiation and progression are characterized by activating mutations in oncogenes (e.g. K-Ras) and functional inactivation of tumor suppressor genes (e.g. p16, p53, DPC4), which may be inherited or acquired. At least one of these genes is altered in pancreatic ductal carcinomas. Because of these alterations important regulatory functions such as cell cycle control, maintenance of genome integrity, expression of growth factors and their receptors are severely perturbed, allowing pancreatic cell transformation to occur. Mutations in the proto-oncogene K-Ras and in the tumor suppressor gene p53 play an important role and their effects on tumorigenecity, invasiveness, angiogenesis and metastasis have been difficult to determine for pancreatic adenocarcinoma in the organ context. The current work has therefore adapted an inducible strategy of stage specific reexpression of the tumor suppressor p53 with an in vivo orthotopic mouse model of pancreatic cancer. The first part of this thesis focused on establishing stable pancreatic carcinoma cell lines with inducible expression of wild type (wt) p53 protein by adding doxycycline (dox) to the media of the cells. This approach resulted in controlled reconstitution of wt p53 function in DanG- and MiaPaCa-2-cells, causing a G1 cell cycle arrest with prominent induction of the cell cycle inhibitor p21 and no evidence of apoptosis induction. In the second part of this thesis the effects of inducible wt p53 expression of growth of MiaPaCa-2 orthotopic xenografts in nu/nu mice was studied. Dox treatment of mice directly after cell implantation as well as in already established tumors significantly inhibited the growth of orthotopic tumors. Furthermore a reduction of macroscopically detected abdominal metastasis was noted in dox treated animals during autopsy. In addition, dox treatment at an early time point of tumor growth led to a significant increase in the number of CD31 and Lyve1 stained vessels, suggesting a pro-angiogenic effect of wt p53 induction. This observation was in good agreement with an increased rate of micro-metastases in liver hilus lymph nodes in dox treated animals. Dox treatment of mice at a later time point of tumor development did not significantly affect the number of CD31 reactive vessels, but again increased lymphatic vessel density. Taken together our observations confirm the established tumor suppressive function of p53 in an orthotopic model of pancreatic cancer. In addition, the increased number of lymphatics and a concomitant increase of micrometastases suggest, that p53 induction affected the biology of different tumor constituents of pancreatic cancer in a complex manner. Our observation suggests that the combination of the inducible system with an orthotopic model can yield important insights into the in vivo tumor biology of pancreatic cancer