Investigation of Endocytosis and Interactions of Tight Junction Proteins

Claudine (Cldn) sind transmembranale tight junction (TJ)-Proteine, welche den parazellulären Spalt in Epithelien und Endothelien abdichten. Durch Interaktionen mit Claudinen in derselben Membran (cis) und in der gegenüberliegenden Membran benachbarter Zellen (trans) regulieren sie den parazellulären Stoffaustausch. TJ-Umbau durch Endozytose und Neueinbau von Claudinen sind essentielle Regulatoren der TJ-Zusammensetzung, worüber die Barriereeigenschaften von Zellschichten bestimmt werden. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der cross-over Endozytose charakterisiert, bei welcher Claudine aus der gegenüberliegenden Membran in die Nachbarzelle endozytiert werden, zusammen mit dem eigenen Claudin. Aminosäuresubstitutionen in der zweiten extrazellulären Schleife von Cldn5 (Cldn5F147A und Cldn5Q156E) führten in MDCK-II-Zellen zu gestörten cis- und trans-Interaktionen und zu beeinträchtigten Barriereeigenschaften, die mit reduzierter Bildung von TJ- Strängen einhergingen. Es wurde gezeigt, dass cross-over Endozytose von Claudin-Claudin-Interaktionen abhängt, da Cldn5F147A und Cldn5Q156E wesentlich seltener cross-over endozytiert wurden als Cldn5. Mittels stimulated emission depletion (STED)-Mikroskopie wurden doppelwandige, Cldn5-haltige Vesikel nachgewiesen. Die äußere Membran dieser Vesikel war in Kontakt mit dem Zytosol, wie durch selektive Proteolyse des zytoplasmatischen Materials bewiesen wurde. Cross-over endozytiertes Cldn5 lokalisierte dagegen im Vesikelinneren. In diesen Vesikeln kolokalisierten verschiedene Claudin- Subtypen sowie Occludin. Es handelt sich somit um einen Prozess, über den zusammenhängende Membranbereiche, nicht aber einzelne Claudine endozytiert werden. Die cross-over Endozytose von Cldn5 war abhängig von Clathrin/Adapterprotein 2 sowie von Caveolin/Cholesterol, aber unabhängig von Dynamin. Außerdem wurde der Abbau cross-over endozytierter Vesikel über den Autophagie/Lysosom-abhängigen Weg nachgewiesen. Cross-over endozytiertes Cldn5 kolokalisierte mit Lysomen sowie mit Autophagosomen-Markern (LC3 und ATG16L). Die Inhibition des lysosomalen Abbaus führte zur Akkumulation von cross-over endozytiertem Cldn5. ATG16L ist bekanntermaßen an der Autophagosomenbiogenese beteiligt und ist typisch für frühe Autophagosomen. Die Präsenz von ATG16L, sowie GFP-LC3 in cross-over endozytierten Vesikeln deutet auf eine direkte Rolle der autophagosomalen Maschinerie für die Endozytose von in die TJs integrierten Claudinen hin. Die Internalisierung von Claudin-abgeleitetem Peptiden erfolgte teilweise über cross-over endozytierte Vesikel, also nach Bindung an Claudine innerhalb der TJ, aber auch über die Bindung an freie Claudine außerhalb der TJs. Insgesamt wurde ein Mechanismus charakterisiert, welcher im Kontext früherer Untersuchungen generelle Bedeutung für das Remodeling von Zellkontakten und die Endozytose trans-interagierender Transmembranproteine aufzeigt. Als Mittel zur Regulierung der Permeabilität von Zellbarrieren spielt cross-over Endozytose von Claudinen eine wichtige Rolle unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.Claudins (Cldns) are transmembranous tight junction (TJ) proteins that seal the paracellular cleft in epithelia and endothelia. They regulate the paracellular solute exchange through Cldn-Cldn interactions along the same membrane (cis) and with Cldns in neighboring cells (trans). TJ-remodeling via endocytosis and incorporation of different Cldns is an essential regulator of TJ-composition which determines the barrier properties of a cell layer. In this study, cross-over endocytosis was characterized, a mechanism during which Cldns are endocytosed into the neighboring cell together with the cell’s own Cldns. Amino acid substitutions in the second extracellular loop of Cldn5 (Cldn5F147A, Cldn5Q156E) led to reduced cis- and trans-interactions, and to impaired barrier function in MDCK-II cells which was accompanied by reduced TJ-strand formation. Cross-over endocytosis was shown to depend on Cldn-Cldn interactions, as Cldn5F147A und Cldn5Q156E were less frequently cross-over endocytosed than wildtype Cldn5. Using stimulated emission depletion (STED)-microscopy the existence of Cldn5-containing, double membrane vesicles was demonstrated. The outer membrane of this vesicle was oriented towards the cytosol, which was confirmed by selective proteolysis of cytoplasmic material. Cross-over endocytosed Cldn5 located towards the lumen of the vesicle. Different Cldn-subtypes as well as occludin were found to colocalize with these vesicles. Therefore cross-over endocytosis is a process that internalizes coherent membrane sections, but not individual Cldn molecules. Cross-over endocytosis depended on clathrin/adapter protein 2 and caveolin/cholesterol but was independent of dynamin. Moreover, degradation of cross-over endocytosed vesicles via the autophagy/lysosomal pathway was demonstrated. Cross-over endocytosed Cldn5 was shown to colocalize with the lysosome, as well as with autophagy markers (LC3, ATG16L). Inhibition of lysosomal degradation led to an accumulation of cross-over endocytosed Cldn5. ATG16L is known to be involved in autophagosome biogenesis and is typically found in early stages of autophagosome formation. The presence of ATG16L and GFP-LC3 in cross-over endocytosed vesicles suggests a direct role for the autophagosomal machinery in the endocytosis of Cldns integrated in the TJs. Internalization of Cldn-derived peptides occurred via binding of the peptides to Cldns inside the TJs and to free Cldns outside the TJs. In conclusion this study characterized a mechanism that, in the context of existing knowledge, has relevance for the remodeling of cell contacts and for the endocytosis of transmembrane proteins with strong associations with the opposing membrane. As a means for the regulation of the permeability of cell barriers cross-over endocytosis plays an important role for physiologic and pathologic conditions