Investigation of the fos-expression in the paraventricular nucleus of the hypothalamus in male rats following a peripheral application of ghrelin

Einleitung Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass der PVN an der Kontrolle der Nahrungsaufnahme beteiligt ist. Unterschiedliche Neurotransmitter, die die Nahrungsaufnahme regulieren, beeinflussen die neuronale Aktivität dieses Hirnkerns. Das Neuropeptid Ghrelin stimuliert nach zentraler Applikation die Kurzzeitnahrungsaufnahme bei Nagetieren und aktiviert Neurone des PVN und NPY- positive Neurone des NARC. Injektionen des Peptids NPY in den PVN wiederum beeinflussen die Plasmaspiegel von ACTH und Kortikosteroiden. Andere Studien zeigten die morphologische Assoziation zwischen NPY-positiven Fasern und CRH- positiven Neuronen im mpPVN. Vermutlich wird im PVN durch Interaktion von Neurotransmittern/-modulatoren die Freisetzung von NPY aktiviert bzw. gehemmt und dadurch die Nahrungsaufnahme reguliert. An dieser Regulation ist möglicherweise auch CRH beteiligt. Während die Aktivierung von Neuronen des PVN nach intrazerebroventrikulärer Injektion von Ghrelin demonstriert werden konnte, blieb sie in bisherigen Untersuchungen nach peripherer Applikation aus. In der vorliegenden Studie wurden die Effekte von intraperitoneal injiziertem Ghrelin auf die Nahrungsaufnahme und die neuronale Aktivierung im Hypothalamus und im Hirnstamm bei Ratten untersucht. Ferner wurden die entsprechenden Neurone und Fasern phänotypisiert. Methoden Zur Untersuchung des Einflusses von Ghrelin auf die Nahrungsaufnahme erhielten männliche Sprague-Dawley Ratten 1 oder 10nmol Ghrelin oder isotone Nariumchloridlösung intraperitoneal injiziert. Die kumulative Nahrungsaufnahme wurde über vier Stunden gemessen. Um eine neuronale Aktivierung im Hypothalamus und im Hirnstamm durch Ghrelin zu überprüfen, wurden die Gehirne männlicher Sprague- Dawley Ratten nach peripherer Ghrelinverabreichung immunhistologisch aufgearbeitet. Dabei wurde 1nmol Ghrelin intraperitoneal injiziert, die Injektion von 1ml Natriumchlorid-Lösung diente als Kontrolle. Nach einer transkardialen Perfusionsfixierung und der Unterteilung der Gehirne in koronare Gewebeschnitte, erfolgte die immunhistologische Markierung des Gewebes. Dabei diente Fos als Marker für neuronale Aktivität im PVN, NTS und NARC. Die Bestimmung des neuropeptidergen Phänotyps der aktivierten Neurone erfolgte mittels einer Doppelmarkierung gegen CRH. Mit einer weiteren Doppelmarkierung gegen NPY wurde der neuropeptiderge Phänotypus der Nervenfasern in den aktivierten Gehirnarealen bestimmt. Ergebnisse Nach ip. Injektion von Ghrelin wurde im Vergleich zur Kontrolle mit Natriumchlorid- Lösung eine signifikant erhöhte kumulative Nahrungsaufnahme beobachtet. Der Vergleich der beiden Versuchsgruppen, die mit 1 bzw. 10nmol Ghrelin/Ratte behandelt wurden, ergab keinen signifikanten Unterschied in der kumulativen Nahrungsaufnahme. Die Auswertung der neuronalen Aktivität im Hypothalamus und im Hirnstamm ergab eine erhöhte Fos-Dichte im PVN und NARC und geringfügig auch in der AP nach ip. Injektion von 1nmol Ghrelin im Vergleich zu isotoner Natriumchlorid-Lösung. Die Fos-Expression im NTS blieb unbeeinflusst durch Ghrelin. Die Doppelmarkierungen zur Bestimmung des neuropetidergen Phänotypus der Neurone und Axone im PVN demonstrierten im Grossteil der Fos-positiven Neurone eine CRH-Expression in deren Zytoplasma und eine NPY-Expression in den umgebenden Nervenfasern. Diskussion Im Gegensatz zu bisherigen Studien, wurde in dieser Arbeit die Aktivierung des PVN nach peripherer Injektion von Ghrelin demonstriert. Da in früheren Studien das Ghrelin intravenös, in der vorliegenden Arbeit jedoch intraperitoneal verabreicht wurde, kann eine Beeinflussung der Ergebnisse durch die unterschiedlichen Applikationswege nicht ausgeschlossen werden. Zum Nachweis der neuronalen Aktivität wurde der Marker Fos genutzt. Da Fos ein unspezifischer Marker ist, kommen andere Faktoren als Ghrelin, wie z.B. Nahrungsaufnahme oder Stress, für seine Induktion in Frage. Um eine sekundäre Fos-Bildung durch Nahrungsaufnahme zu verhindern, wurde den Versuchtieren während der Experimente die Nahrung entzogen. Ob die Versuchstiere starkem Stress ausgesetzt waren, kann nicht mit Sicherheit gesagt werden. Somit könnte Angst oder durch Hunger ausgelöster Stress bei den Versuchstieren Fos induziert haben. Was jedoch dagegen spricht ist die signifikant höhere Fos-Expression im PVN der ghrelinbehandelten Tiere im Vergleich zur Kontrolle mit Natriumchloridlösung. Der Nachweis von CRH und NPY in aktivierten Arealen des PVN lässt ein Zusammenspiel dieser Peptide mit Ghrelin vermuten. Dabei aktiviert Ghrelin möglicherweise Neurone des PVN indirekt über NPY-positive Projektionen zwischen dem NARC und dem PVN. Ferner wird angenommen, dass Ghrelin die Nahrungsaufnahme durch die Beeinflussung des CRH-Spiegels stimuliert. Um diese Hypothese zu bekräftigen, müssten weitere histochemische Untersuchungen und Tracingstudien durchgeführt werden. Die Bedeutung vagaler Afferenzen bezüglich der Wirkung von peripherem Ghrelin auf die Nahrungsaufnahme wurde in dieser Arbeit nicht untersucht.Introduction Several studies have shown the involvement of the PVN in the regulation of food intake. Different neurotransmitters regulating the food intake influence the activity of this nucleus. The neuropeptide ghrelin stimulates the food intake in rodents after central application and activates PVN neurons as well as NPY-positive neurons of the NARC. Injections of NPY into the PVN on the other side influence serum levels of ACTH and Corticosteroids. Morphological associations between NPY-positiv axons and CRH- positive neurons in the pmPVN have been shown by other studies. The food intake is most probably regulated by neurotransmitters/- modulators within the PVN, which by interacting with each other activate or inhibit the release of NPY. CRH might be involved in this regulatory circuit. Intracerebroventricular injections of ghrelin have been shown to activate neurons of the PVN, however peripheral applications failed to demonstrate such an activity in previous studies. In the present study the effect of intraperitoneally applied ghrelin on the food intake and the neuronal activity in the hypothalamus and brainstem in rats was investigated. Furthermore a phenotypical characterization of the relevant neurons was performed. Methods To investigate the effect of ghrelin on the food intake , male Sprague-Dawley rats were injected intraperitoneally 1 or 10 nmol ghrelin per animal or isotonic sodiumchlorid solution. The food intake was measured over a four hour period. For the investigation of the effect of ghrelin on the hypothalamus and the brainstem, male Sprague-Dawley rats were given 1nmol ghrelin intraperitoneally and immunohistological studies were performed on the brain tissue. The control group received isotonic sodiumchloride solution. Following a transcardiac perfusion fixation, the brain tissue was processed, cut into coronary tissue sections and immunohistologically stained. Fos was used as a marker for neuronal activity in the PVN, NTS and NARC. The phenotypical characterization of the activated neurons was performed via a double staining for CRH. A double staining for NPY was used to characterize the axons in the activated areas. Results Following an intraperitoneal injection of ghrelin the food intake rose significantly compared to the control group. The comparison between both ghrelin groups, which received either 1 nmol or 10 nmol ghrelin per animal did not reveal any significant difference regarding the food intake. The interpretation of the neuronal activity in the hypothalamus and in the brainstem demonstrated a significant increase in the fos-expression in the PVN and NARC and a slight increase in the AP after ghrelin administartion compared to the control group. No differnce in the neuronal activity was observed in the NTS. The doublestaining for the phenotypical characterization of the neurons and axons in the PVN demonstrated that the majority of the fos-positive neurons expressed CRH in their cytoplasm and that the surrounding axons were NPY- positive. Discussion In contrary to previous publications, the present study demonstrated the activation of the PVN by peripheral administration of ghrelin. Given the fact, that in previous studies ghrelin had been injected intravenously, and in the present study it was applied by intraperitoneal injection, a difference caused by the different application routes cannot be excluded. Fos is an unspecific marker for neuronal activity and many factors, such as food intake or stress, can stimulate its expression. To prevent a secondary fos induction by food intake, the animals were fasted during the experiments. It is difficult to say wether the animals were exposed to extreme stress. Fear or hunger could have induced fos. However, this does not explain the significantly higher fos-expression in the PVN of the ghrelin treated animals compared to the control group. The demonstration of CRH and NPY in the activated PVN areas is suggestive for an interaction between these peptides with ghrelin. Ghrelin most probably activates neurons of the PVN indirectly via NPY-positive projections between the NARC and the PVN. Furthermore, it is believed that ghrelin stimulates the food intake by influencing CRH levels. Further histochemical and tracing studies have to be done to prove this hypothesis. The relevance of afferent vagal fibers regarding the effects of ghrelin on the food intake was not investigated in this study